Zusammenfassung
Hintergrund
Porphyromonas gingivalis
Osteoblasten gezeigt wurde, zu erobern und ihre Differenzierung und Mineralisierung in vitro zu inhibieren. Es ist jedoch unklar, ob P. gingivalis
Osteoblasten in vivo eindringen können und wie diese alveolären Osteoblasten /Osteoklasten Dynamik beeinflussen würde. Diese Studie hat zum Ziel, diese Fragen mit einer Parodontitis Mausmodell unter repetitiven P. gingivalis
Impfungen zu beantworten.
Methoden
Für 3 Monate alten BALB /cByJ weibliche Mäuse, 10
9 CFU von P. gingivalis
auf den Zahnfleischsaum von Oberkiefermolaren 4 mal in 2-tägigen Intervallen geimpft wurden. Nach 2 Wochen wurden weitere 4 Inokulationen in 2-tägigen Intervallen angewendet. Calcein wurde 7 und 2 Tage injiziert, bevor die Tiere zu opfern die neu gebildete Knochen zu beschriften. Vier Wochen nach der letzten Impfung wurden die Mäuse getötet und Maxilla gesammelt. Immunhistochemie, Mikro-CT und Knochenhistomorphometrie wurden an den Proben durchgeführt. Sham Infektion mit nur Fahrzeug war die Kontrolle.
Ergebnisse | P. gingivalis
gefunden wurde gingivalen Epithels, Desmodonts Fibroblasten einzudringen, und alveolären Osteoblasten. Micro-CT zeigten Alveolarknochenresorption und signifikante Verringerung der Knochenmineraldichte und der Inhalt in den infizierten Mäusen im Vergleich zu den Kontrollen. Knochenhistomorphometrie zeigten eine Abnahme in Osteoblasten, eine Zunahme der Osteoklasten und der Knochenresorption, und eine überraschend erhöhte osteoblastische Knochenbildung in den infizierten Mäusen im Vergleich zu den Kontrollen.
Schlussfolgerungen
P. gingivalis
alveolären Osteoblasten in die infiltriert Parodontitis Mausmodell und Alveolarknochen Verlust führen. Obwohl P. gingivalis
Osteoblasten-Pool zu unterdrücken, erscheint und Knochenresorption durch Osteoklasten zu erhöhen, wird die Knochenbildung Kapazität in den infizierten Mäusen vorübergehend erhöht, möglicherweise über einige antimikrobieller ausgleichend Mechanismen.
Schlüsselwörter Osteoblasten P. gingivalis
Invasion Micro-CT Knochenhistomorphometrie elektronische ergänzendes Material
die Online-Version dieses Artikels (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-89) enthält zusätzliches Material, das autorisierten Benutzern zur Verfügung steht <. br> Hintergrund
Periodontitis wirkt sich auf 20% der Weltbevölkerung [1]. Es ist ein Hinweis auf schlechte Mundgesundheit und ist zu einem schlechten Allgemeinzustand und einer Beeinträchtigung der Lebensqualität verbunden, vor allem in der geriatrischen Bevölkerung [2]. Das Markenzeichen der Parodontitis ist der Verlust der Konnektivität zwischen dem Zahn, parodontalen Gewebe und Alveolarknochen. Zerstörung von Gewebe und Resorption von Knochen zur Bildung der Zahnfleischtasche, einem vergrößerten subgingivalen Raum, der ein Schutzraum für periodontale Mikroorganismen ist. Die Entwicklung der Parodontitis ist eine multifaktorielle Prozess um komplexe Wirt-Mikroorganismus-Wechselwirkungen revolvierenden [3]. P. gingivalis
ist ein gram-negatives schwarz pigmentierte Anaerobier, die die subgingivalen crevice kolonisiert, und hat sich als eine der wichtigsten periodontale Pathogene identifiziert wurden. Es hat mehrere bekannte Virulenzfaktoren, die, dass mehrere Komponenten von P. gingivalis gibt an, in der oralen Umgebung, wie Fimbrien, gingipains, Lipopolysaccharide (LPS), die Kapsel und Hämagglutininarten [4].
Reichlich Beweise für ihr Überleben beitragen
kann auf Osteoblasten wirken alveolären Knochenbildung zu hemmen. P. gingivalis LPS
, Lipiden, Stoffwechselprodukte und beschallt Extrakte können die Differenzierung und die Osteogenese von Osteoblasten [5-10] zu hemmen, und zu modulieren RANKL (Rezeptor-Aktivator von nuclear factor-kappaB-Ligand) und /oder OPG (Osteoprotegerin) expression in Osteoblasten indirekt osteoclastogenesis [11-14] stimulieren. Vor kurzem hat unser Labor festgestellt, dass P. gingivalis
Osteoblasten eindringen können und deren Reifung und Mineralisierung in vitro hemmen [15], und Fimbrien eine wichtige Rolle spielen, um die anfängliche invasive Verfahren bei der Vermittlung [16].
Parodontalpathogenen haben gezeigt worden, auf Alveolaroberfläche eindringen und leere Lakunen bei Patienten mit schwerer Parodontitis [17] belegen. Es ist nicht klar, ob P. gingivalis
Osteoblasten in vivo eindringen kann, und wenn ja, wie würde dies Knochenhomöostase an infizierten Stellen beeinflussen. Mäuse haben keine P. gingivalis
als Teil ihrer endogenen Mundflora [18]. Allerdings haben Parodontitis und Alveolarknochen Verlust erfolgreich bei Mäusen durch intraorale Impfung von lebenden P. gingivalis
[19-21] induziert. Das Ziel der vorliegenden Studie ist es, die Invasion der alveolären Osteoblasten von P. gingivalis
zu untersuchen, und wie Osteoblasten-Osteoklasten-Kopplung wird durch eine bakterielle Infektion in einer Parodontitis Mausmodell unter repetitiven P. gingivalis
Impfungen betroffen. Es wurde festgestellt, dass P. gingivalis
der Lage war, parodontalen Zellen einzudringen und die Homöostase von Osteoblasten und Osteoklasten stören, der Alveolarknochen Verlust trägt letztlich zu.
Methoden
Bakterien und Kulturbedingungen
P. gingivalis 10% Kohlendioxid:: 4% Wasserstoff
Stamm ATCC 33277 wurde bei 37 ° C in einem Coy anaeroben Kammer unter einer Atmosphäre aus 86% Stickstoff anaerob gezüchtet. Kulturmedien war Trypticase Soy Broth (TSBY), supplementiert mit 5% Hefeextrakt, 2% Natriumbicarbonat, 7,5 uM Hämin und 3 uM Menadion. TSB Blutagarplatten (BAP) wurden mit dem Zusatz von 5% Schafsblut und 1,5% Agar hergestellt. Die Bakterien wurden von BAP in 5 ml TSBY inokuliert und anaerob für 18 bis 24 Stunden bei 37 ° C, dann in TSBY verdünnt und zu frühen logarithmischen Phase gezüchtet. Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit geerntet, gewaschen und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert. Die Konzentration der Bakterien wurde mit einem Spektrophotometer bei einer optischen Dichte von 600 nm (OD & sub1; = 10 9P. Gingivalis
pro ml) bestimmt. 10 9 CFU von lebenden P. gingivalis und Videos Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit gesammelt und pelletiert wurde, dann in 20 ul PBS mit 2% Carboxymethylcellulose suspendiert. Die Bakteriensuspension auf den Zahnfleischsaum der Maus Oberkiefermolaren angewandt wurde, wie unten beschrieben.
Bakterielle Impfungen
Eine Maus Parodontitis mit leichten Modifikation der zuvor beschriebenen Verfahren festgestellt wurde [22]. Kurz gesagt, wurden 10-12 Wochen alte BALB /cByJ weibliche Mäuse in spezifischen Pathogen freien Umgebung gehalten. Sie erhielten Kanamycin bei 1 mg /ml in deionisiertem Wasser ad libitum 7 Tage. Drei Tage nach der Behandlung mit Antibiotika wurden die Mäuse unter kurzen Isofluran-Narkose gelegt und 10 9 CFU von lebenden P. gingivalis
in 20 ul PBS mit 2% Carboxymethylcellulose angewendet wurde dem Zahnfleischsaum der Maus Oberkiefermolaren viermal, 2 Tage auseinander. Die Mäuse wurden von Futter- und Wasseraufnahme für 1 Stunde nach der Impfung zurückgehalten. Wir haben eine Impfung Konzentration von 1 x 10 9 CFU, da unsere erste Studie zeigte, dass diese Konzentration, die ausreichend war P. gingivalis
Invasion des Parodontiums und Alveolarknochen Verlust zu induzieren. Sham infizierten Gruppe erhielt 20 ul PBS mit 2% Carboxymethylcellulose allein. Zwei Wochen später weitere vier Dosen (2 Tage auseinander) wurden den Mäusen aufgetragen. Vier-Wochen nach der zweiten mündlichen Herausforderung wurden die Mäuse getötet und die Kieferproben wurden für die Mikro-CT und Knochenhistomorphometrie Studien gesammelt. Für P. gingivalis
invasion Untersuchung, Immunhistochemie wurde an Proben durchgeführt Maxilla 3 Tage nach dreimal bakterieller Inokulation gesammelt. Zehn Tiere wurden jeweils sowohl für die für die oben genannten Studien infizierten und Scheingruppen enthalten. Alle im Zusammenhang mit Tieren Versuche wurden vom Zentrum für Labortier Medizin und Pflege an der University of Texas Health Science Center in Houston (genehmigtes Tier Protokoll HSC-AWC-10-145) zugelassen.
Immunhistochemie
Mäuse Kieferproben wurden isoliert, in 10% neutral gepuffertem Formalin fixiert, entkalkt, in 3,4% Natriumformiat /15% Ameisensäure und in Paraffin eingebettet. Antigen Retrieval wurde bei 37 ° C für 10 min unter Verwendung von 4 N HCl durchgeführt. Endogene Peroxidase-Aktivität wurde durch Inkubation von 10 min mit 3% H 2 O 2 blockiert. Die nicht-spezifische Proteine wurden mit DAKO Protein Block (Dako, Carpinteria, CA) für 30 min bei Raumtemperatur (RT) blockiert. Die Schnitte wurden für 1 h bei RT inkubiert und mit 1: 4000 Kaninchen anti- P. gingivalis
polyklonalen Antikörper. Sekundäre Antikörper und Substrat-Färbung wurden mit DAKO LSAB + Kit und Flüssigkeit DAB + Substrat-Chromogen-System (Dako) durchgeführt. Die Objektträger wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt. Die Anzahl der Osteoblasten mit bakterieller Invasion wurde manuell gezählt. Für beide P. gingivalis
infiziertem und Kontrollgruppen wurden 10 Proben analysiert. Die Gesamtzahl der Osteoblasten auf dem Abschnitt Alveolarknochen Oberfläche wurde Auskleiden gezählt. Die Formel Prozentsatz positiver Färbung cacluate war: (Anzahl der braun-gefärbten Osteoblasten /Gesamtzahl der Osteoblasten gezählt) × 100
Micro-CT Vier Wochen nach der letzten Impfung
wurden Maus Kiefers gesammelt und abgebildet mit. ein Scanco Mikro-CT-40 (SCANCO Medical, Brüttisellen, Schweiz) bei einer Auflösung von 12 Mikrometer. Die Mikro-CT-Bilder wurden am Baylor College of Medicine Mikro-CT-Core Facility erworben und rekonstruiert eine modifizierte Feldkamp-Methode [23]. Die Bilddaten wurden analysiert, ähnlich dem, was von Park et al beschrieben. [24]. Kurz gesagt, wurden umorientiert alle Bilder, so dass die Schmelz-Zement-Grenze (SZG) und Wurzelspitze (RA) in der gleichen Schicht auftreten. Der interessierende Bereich (ROI) wurde manuell auf die axialen Ebenen zwischen der medialen Wurzeloberfläche des ersten Molaren und der distalen Wurzeloberfläche des dritten molar gezogen. Die Konturen wurden kontinuierlich alle 5 Datenebenen vom Dach der Furkations ganzen Weg zur Wurzelspitze gezogen, bis ein dreidimensionales (3D) ROI erzeugt wird (Abbildung 1). Alle Wurzelvolumen wurden aus dem ROI ausgeschlossen des Gesamtvolumens (TV) zu berechnen. Die Parameter für jede zu analysierende Probe enthalten Knochenvolumenanteil (BVF = BV /TV), die Knochenmineraldichte (BMD, normiert auf eine Hydroxylapatit phantom) und Knochenmineralgehalt (BMC = BMDX BV). Abbildung 1 Verfahren zur 3D-ROI (Region of Interest) zu erzeugen, die in Mikro-CT-Analyse des Alveolarknochens. Zweidimensionale Konturen wurden manuell alle fünf Datenebenen auf der axialen Ansicht aus dem Dach der Furkations zur Wurzelspitze gezogen. Wurzeloberfläche wurde von der Knochenfläche auf jeder Ebene gemessen ausgeschlossen. Ein 3D-ROI wurde erstellt, nachdem alle 2D-Konturen gezeichnet wurden. Alveolarknochen Volumen wurde als Gesamt-ROI minus Wurzelvolumen berechnet.
Knochenhistomorphometrie
Vier Wochen nach der letzten Impfung, Maus Oberkiefers wurden gesammelt und in zwei Hälften geschnitten für statische und dynamische Histomorphometrie Analyse sind. Für dynamische Histomorphometrie erhielten die Mäuse 10 mg /kg Körpergewicht von Calcein in 2% NaHCO3 intraperitoneal 7 und 2 Tage vor der Tötung des neu gebildeten Knochen zu etikettieren. Maxilla wurden frei von Weichgewebe und Kronen der Zähne wurden amputiert entlang Alveolarknochen Oberfläche seziert. Proben wurden in 70% Ethanol fixiert für 3-5 Tage, dehydriert in Konzentrationen von Ethanol, in Xylol geklärt erhöht und entkalkte in Methylmethacrylat eingebettet. Fünf Mikrometer dicke Schnitte wurden geschnitten parallel zu der langen Achse der Molaren und Abschnitte in der Nähe des Zentrums von Pulpakammern wurden ungefärbt montiert zur Visualisierung von Mineralisierungs Oberfläche unter UV-Licht mit einer I3-Filter. Für statische Messung Maxilla wurde in 4% Paraformaldehyd in PBS fixiert, pH 7,4, bei 4 ° C für 2-5 Tage. Die Knochen wurden in EDTA /NH 3OH für weitere 2-5 Tage entkalkt und dehydrierte in Konzentrationen von Ethanol, in Xylol geklärt erhöht und in Paraffin eingebettet. Die eingebetteten Knochen wurden mit der langen Achse der Molaren geschnitten parallel und Abschnitte in der Nähe des Zentrums von Pulpakammern wurden montiert. Aufeinanderfolgende Schnitte wurden mit Toluidinblau (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) oder Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP, Sigma-Aldrich) zur Visualisierung von Osteoblasten und Osteoklasten gefärbt sind. Die Zelltypen wurden weiter durch ihre charakteristische Morphologie validiert, wie quader für Osteoblasten und Osteoklasten kernige für. Alle der Osteoblasten und Osteoklasten auf dem gesamten Abschnitt wurden, zählte die räumlichen Veränderungen in ihren Verteilungen zu vermeiden. Histomorphometrische Messungen wurden verblindet, nonbiased Weise gemacht, und die Terminologie und verwendeten Einheiten waren die von der Histomorphometrie Nomenclature Committee der American Society for Bone and Mineral Research empfohlen [25]. Alle Knochenhistomorphometrie Analyse an der University of Texas MD Anderson Cancer Center Knochenhistomorphometrie Core Facility durchgeführt wurde, die Bioquant Osteo II computerisierten Bildanalysesystem (BIOQUANT Bild Analysis Corporation, Nashville, TN) mit einem Leica DM 1000 Mikroskop (Leica Microsystems eine Schnittstelle verwenden, Wetzlar , Deutschland). Statistik
P. gingivalis
infiziertem und Schein Gruppen haben je 10 Tieren für alle Experimente. Die statistische Analyse von Student t-Test durchgeführt wurde Signifikanz zwischen den Gruppen zu bestimmen (p & lt; 0,05).
Ergebnisse | P. gingivalis
gingivalen Epithelzellen eindringt, Desmodonts (PDL) Zellen und alveolären Osteoblasten in der Parodontitis Mausmodell
drei Tage nach dreimal der mündlichen Herausforderung mit P. gingivalis
, Immunhistochemie positive Färbung gingivalis für P. zeigte
in gingivale Epithelzellen, PDL-Fibroblasten, Osteoblasten die Alveolaroberfläche Futter und Osteozyten eingebettet in Knochenmatrix in der infizierten Gruppe, aber keine Färbung wurde in der Kontroll sham-infizierten Gruppe (2) erfaßt. Etwa 17,6 ± 2,1% des alveolären Osteoblasten hatte Invasion von P. gingivalis
basierend auf manuellen Zählung. Positiv-gefärbte (braun) parodontale Fibroblasten wurden gleichmäßig im Bindegewebe verteilt. Dieses Ergebnis zeigt, dass P. gingivalis
erfolgreich tief Parodontium in unserem Periodontitis Tiermodell befällt. Abbildung 2 P. gingivalis eindringen parodontalen Weich- und Hartgewebe nach wiederholter Impfungen wie durch Immunhistochemie gezeigt. Die Immunhistochemie wurde nach dreimaligem von P. gingivalis
Inokulationen drei Tagen durchgeführt. A. Sham-infizierten Kontrolle. Anti-P. gingivalis
primäre Antikörper wurde in dem Assay verwendet. Blau ist Hämatoxylin Gegenfärbelösung. Beachten Sie dort keine braune positive Färbung ist für P. gingivalis in Parodontium
. B. P. gingivalis
infizierten Tieren, mit anti-P. gingivalis
primären Antikörpers aus dem Assay ausgeschlossen, die in dem Parodontium keine positive Färbung zeigt. Dies zeigte, gab es keine unspezifische Färbung von sekundärem Antikörper und /oder das Substrat. C. P. gingivalis
infizierten Tieren, mit anti-P. gingivalis
primärer Antikörper, die in dem Test. Umfangreiche Färbung für P. gingivalis
wurde in gingivale Epithelzellen, PDL Fibroblasten und alveolären Osteoblasten bemerkt. D. vergrößerte Ansicht in C. Positive P. gingivalis
Färbung wurde in Fibroblasten nachgewiesen (gekennzeichnet durch rote Pfeile) in Desmodontalspalt, Osteoblasten des Kieferknochenoberfläche Futter (durch schwarze Pfeile) und in einem osteocyte in der eingebettete Alveolarknochen Matrix (durch schwarze Pfeilspitze bezeichnet). Abkürzungen: CT, Kontrolle, schein-infiziert; PG, P. gingivalis
infiziert; Ab, Antikörper; R, Wurzel; E, gingivale Epithelzellen; PDL, Desmodonts; B, Alveolarknochen; Skala bar = 20 & mgr; m.
P. gingivalis
Infektion Verlust des Alveolarknochens Volumen und Dichte verursacht
Vier Wochen nach der letzten oralen Inokulation mit P. gingivalis
, Proben Maxilla Maus wurden mit gesammelt und abgebildet Micro-CT-Scanner. Die Micro-CT-Bilder zeigen verminderte Alveolarknochen Höhe und Furkations Resorption von Maus Molaren (3A) und eine Abnahme der Mineraldichte des Alveolarknochens vor allem am Zahnfleischsaum in den infizierten Mäusen im Vergleich zum Scheinkontrolle (3B). Quantifizierung der Mikro-CT-Ergebnisse zeigt signifikante Reduktion des Alveolarknochens Volumenfraktion, Knochenmineraldichte und der Knochenmineralgehalt von infizierten Tieren im Vergleich zu den Kontrollen (3C-E). Abbildung 3 P. gingivalis-Infektion führt zu einem Verlust von Alveolarknochen Volumen und Dichte, wie durch Mikro-CT nachgewiesen. Micro-CT-Analyse wurde vier Wochen nach insgesamt acht bakterieller Inokulation durchgeführt. Verminderte Alveolarknochen Höhe und Furkationsbeteiligung (A) und Mineraldichte an der Alveolaroberfläche (B) verringert wurde in den infizierten Tieren bemerkt. Im Feld A weisen rote Pfeile auf der Furkationsbeteiligung. In Feld B, desto dunkler rötlich-violette Farbe zeigt Bereiche geringerer Mineraldichte. Quantifizierung der Mikro-CT-Daten zeigen, dass wiederholte P. gingivalis
Infektion eine signifikante Reduktion der Alveolarknochen Fraktion (C) hervorgerufen, die Knochenmineraldichte (D), und der Knochenmineralgehalt (E) im Vergleich zu den Kontrollen. Abkürzungen: CT, Kontrolle, schein-infiziert; PG, P. gingivalis
infiziert; BV /TV% und blieb Alveolarknochen Volumen über Gesamtvolumen; BMD, Knochenmineraldichte (bis Hydroxylapatit Phantom normalisiert); BMC, Knochenmineralgehalt (= BMD X BV); * Bezeichnet P & lt; 0,05 im Vergleich zu den Kontrollen.
P. gingivalis
Infektion führt zu einer Erhöhung der Knochenresorption durch Osteoklasten und einer kompensatorischen Erhöhung der Osteoblasten-Knochenbildung
Um zu bewerten, wie Osteoblasten /Osteoklasten Kopplung von P. gingivalis betroffen war
, Knochenhistomorphometrie Analyse wurde an den Oberkiefer Proben durchgeführt. Bakterielle Infektion verursacht eine Abnahme der Osteoblastenzahl (4A, D und E), eine Erhöhung der Osteoklastenzahl (4B, D und E) und erhöhte Alveolarknochenresorption (4F). Unerwartet wurde osteoblastischen Knochenbildung von P. gingivalis
stimuliert, wie durch deutlich höhere MS /BS% (Prozent der Mineralisierungs Oberfläche des gesamten Knochenoberfläche gemessen, 4C und F) gezeigt, MAR (Mineral Appositionsrate, 4C und G) und BFR /BS (Knochenbildungsrate, 4C und G) in der infizierten Gruppe mit den Kontrollen verglichen. Abbildung 4 P. gingivalis Ergebnisse Infektion zu einer erhöhten Knochenresorption durch Osteoklasten und Osteoblasten-erhöhte Knochenbildung, wie durch Knochen histomorphometric Analyse gezeigt. Knochenhistomorphometrie wurde vier Wochen nach insgesamt acht bakterieller Inokulation durchgeführt. A. Toluidinblaufärbung für Osteoblasten. Die Pfeile bezeichnen Osteoblasten in Kontakt mit dem Kieferknochenoberfläche. B. TRAP-Färbung für Osteoklasten, die mehrkernige Zellen rotgefleckten sind. C. Calcein Verdoppelung Kennzeichnung neu gebildeten Knochen zu zeigen. Der Bereich zwischen den Doppelhellgrünen Linien ist, wo der neue Knochen gebildet wird. D-G, quantifizierte Knochenhistomorphometrie Daten. Eine signifikante Abnahme der Osteoblastenzahl (D und E), erhöhte Osteoklastenzahl (D und E) und eine erhöhte Knochenresorption durch Osteoklasten (F) wurde in den infizierten Tieren beobachtet. Überraschenderweise wurde osteoblastische Knochenbildung in den verbleibenden Osteoblasten (F und G) stark erhöht. Abkürzungen: CT, Kontrolle, schein-infiziert; PG, P. gingivalis
infiziert; B, Alveolarknochen; R, Wurzel; PDL, Desmodonts; Ob.S /BS%, Prozent Knochenoberfläche mit Osteoblasten gesäumt; Oc.S /BS%, Oberflächen Prozent Knochen mit Osteoklasten bedeckt; N.Ob /B. Pm, die Anzahl der Osteoblasten pro Knochen Umfang; N. Oc /B. Pm, die Zahl der Osteoklasten pro Knochen Umfang; MS /BS% Prozent der Mineralisierungs Oberfläche des gesamten Knochenoberfläche gemessen; ES /BS%, Oberflächen Prozent Knochen durch Osteoklasten erodiert; MAR, Mineral Appositionsrate; BFR /BS, Knochenbildungsrate; * Bezeichnet P & lt; 0,05 im Vergleich mit den Kontrollen. Maßstabsbalken = 20 & mgr; m.
Diskussion
In dieser Studie untersuchten wir Invasion des Parodontiums von P. gingivalis
und wie bakterielle Infektion Einflüsse alveolar Dynamik Knochen eine Parodontitis Maus-Modell. Murine Modelle wurden extensiv zu erforschen, die Pathogenese von Parodontalerkrankungen und Behandlungsmodalitäten zu entwickeln, weil die periodontale Anatomie und Histopathologie parodontaler Läsionen in Mäusen sind ähnlich denen gefunden beim Menschen [26] verwendet. Darüber hinaus geringe Kosten, Einfachheit der Handhabung, bekannt Genetik, eine wohldefinierte Immunsystem und steuerbarer orale Mikroflora begünstigt murine gegenüber anderen Tierarten in periodontal Studien [27, 28]. Verschiedene Verfahren wurden in der Literatur zur Abgabe von periodontalen Krankheitserreger in der Mundhöhle von Versuchstieren, wie beispielsweise mit einer Diät, Bakterien getränkte Ligatur Schlundsonde oder direkte Anwendung von Bakteriensuspension zu Gingiva [18, 21, 26, 29, präsentiert 30 ]. Um eine ortsspezifische Infektion zu erreichen und gingivalen Schäden durch Ligatur zu vermeiden, wir leben P. gingivalis
in leicht viskosen Lösung (2% Carboxymethylcellulose in PBS) und wendete sie direkt am Zahnfleischsaum der Maus Oberkiefermolaren suspendiert.
Unsere Parodontitis Mausmodell ist eine sehr vereinfachte Simulation klinischer Parodontitis in der Patientenpopulation. Wir haben einzelne P. gingivalis
hauptsächlich Infektion zu sehen, ob sie Parodontium in vivo eindringen können und parodontalen Knochenverlust verursachen. Da das menschliche Sulkus ist haben ein habitant für hoch diversifizierte Mundflora [31], weitere Studien mit polymikrobiellen Parodontitis Tiermodellen würde einen zusätzlichen Einblick auf den Pathomechanismus der Parodontitis.
In-vitro-Studien gezeigt, dass P. gingivalis
infiltrieren Mensch verwandelt und primäre als auch gingivale Epithelzellen als mehrschichtige Tasche Epithelzellen [32-35]. Mit Hilfe eines gentechnisch menschlichen Modell Mundschleimhaut, bestehend aus normalen menschlichen Epithelzellen und Fibroblasten und einem wiederhergestellten Basalmembran-Modell (Matrigel), P. gingivalis
mehrschichtigen Epithelzellen gezeigt wurde, zu infiltrieren, wandern durch die Basalmembran, und erreichen den zugrunde liegenden Bindegewebe [36]. In-vivo-Studien haben die Invasion des menschlichen creviculare und bukkalen Epithelzellen [37-39] und Gewebeinvasion gingivaler Biopsieproben von P. gingivalis
nachgewiesen [40, 41]. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Parodontalpathogenen tief parodontalen Gewebe in vivo eindringen können. Unsere Studie zeigt, Immunhistochemie Invasion von gingivalen Epithelzellen, Fibroblasten, Alveolarknochen Futter Osteoblasten und eingebettete Osteozyten von P. gingivalis an den infizierten Stellen 3 Tage nach mehreren oralen Impfungen
. Dies ist die erste Studie, die zeigen, dass dieses periodontal pathogen eindringenden alveolären Osteoblasten in vivo fähig ist. Mehrere Virulenzfaktoren von P. gingivalis
, insbesondere Fimbrien und gingipains kann eine wichtige Rolle bei der Erleichterung der intrazelluläre Invasion und extrazellulären Abbau spielen und letztlich Progression und Expansion der parodontalen Schäden [4, 42, 43]. Unsere bisherigen in vitro-Studie zeigt, dass Fimbrien für die erste Invasion von P. gingivalis wesentlich sind
in Osteoblasten, aber für die Persistenz von Bakterien in Wirtszellen [16] kann nicht so kritisch sein.
Anfängliche Besiedlung /Infektion zu demonstrieren von P. gingivalis in Maus Mundhöhle
, eine Kurzzeitstudie Immunhistochemie wurde durchgeführt, um die Invasion von periodontalen Zellen von P. gingivalis
drei Tage nach dreimal bakterieller Inokulation zu bewerten. Diese frühe Phase wurde gewählt, weil wir, dass die Anwesenheit von P. gingivalis demonstrieren wollte
innerhalb der periodontalen Zellen war hauptsächlich auf invasion statt intrazellulären Vermehrung der Bakterien. Immunhistochemische Färbung zeigten Eintrag von P. gingivalis
in verschiedene parodontalen Zellen. Doch innerhalb dieses kurzen Zeitfensters keine nennenswerte apikale Migration von Saumepithel und Taschenbildung wurde bemerkt. Scheinbare alveolären Knochenverlust wurde erst viel später erkannt, die 4 Wochen nach insgesamt 8 Inokulationen war. Keine offensichtlichen histologischen Anzeichen einer Entzündung, wie Infiltration von Entzündungs (polymorphkernige Leukozyten, Lymphozyten) Zellen im Bindegewebe, wurde in unseren frühen Phase Immunhistochemie Studie nachgewiesen. Dies war wahrscheinlich aufgrund der intrinsischen geringe Fähigkeit von P. gingivalis
zu Wirtsimmun /Entzündungsreaktionen [44-47] stimulieren. Zellwandextrakten und gereinigten Zellkomponenten von P. gingivalis
vergleichsweise schwachen Gastgeber immunstimulatorischen Aktivität haben [44-47]. P. gingivalis
aktiv die Sekretion von neutrophil chemoattractant Interleukin hemmen können (IL) -8, IL-1β und IL-18 [48, 49]. Vielleicht, die Unterdrückung von Host angeborenen Immun & amp; entzündliche Reaktionen, die durch P. gingivalis
könnte die Aufrechterhaltung der chronischen Zustand der Infektion während der parodontalen Erkrankungen erleichtern. Bakterien, die von P. gingivalis
in den polymikrobiellen Mundflora scheinen sehr robust Wirtsimmun & amp vermitteln zu können; Entzündungsreaktionen [30, 49]. Unsere Ergebnisse zeigten, dass eine direkte Invasion von P. gingivalis
in Osteoblasten Osteoblasten Pool unterdrückt und gestört Osteoblasten /Osteoklasten Hämostase, was zu einem Netto-Knochenverlust. Alveolarknochen Zerstörung durch Allerdings Host entzündliche Reaktion auf P. gingivalis kann
nicht ausgeschlossen werden.
P. gingivalis
Invasion der parodontalen Zellen wurde als spezifische intrazelluläre braune Färbung für die Bakterien nachgewiesen, die in den Kontrollgruppen nicht anwesend ist. Toluidinblau-Färbung an aufeinanderfolgenden Gewebeschnitten bestätigt, dass die quaderförmige Zellen auf der alveolären Knochenoberfläche wirklich waren Osteoblasten (Daten nicht gezeigt). Mit der Kraft des Lichtmikroskops, die wir verwendet, um die Bilder zu erfassen, können einzelne Bakterium nicht aufgelöst werden. Stattdessen zeigten die Zellen mit bakteriellen Invasion interpunktieren oder braune zytoplasmatische Färbung diffundieren. Zukünftige Transmissionselektronenmikroskopie Studie kann ferner die subzelluläre Lokalisation der Bakterien identifizieren.
Unsere Mikro-CT-Studie verringerte sich zeigt deutlich Rest Alveolarknochen Volumen und Mineraldichte in der P. gingivalis
infiziertem Tiere im Vergleich zu den schein-infiziert Kontrollen, die mit früheren Berichten [30, 50] im Einklang steht. Die alveoläre Knochendichte schien am Zahnfleischsaum als Rest der Fläche in den infizierten Tieren (3B), wahrscheinlich aufgrund der Abnahme Nähe zu den Bakterien und deren sezerniert Virulenzfaktoren an diesen Oberflächen zu schließen.
Die Knochenhistomorphometrie Analyse erhöhte Osteoklastenzahl und Knochenresorption durch Osteoklasten in den infizierten Tieren ergab im Vergleich zu den Kontrollen, die andere Ergebnisse ähnlich ist [50]. Interessanterweise für Osteoblasten Parameter signifikant verringert Zahlen Osteoblasten aber deutlich erhöhte Knochenbildungsaktivität wurde in den infizierten Tieren bemerkt. Unsere bisherigen in vitro-Studie zeigt, dass P. gingivalis
unterdrückt zunächst aber später fördert Osteoblasten Apoptose auf sich wiederholende Impfungen [51]. Unter Berücksichtigung des zeitlichen Verlaufs der in vivo-Studie konnte die verminderte Osteoblastenzahl zu einer erhöhten Apoptose und /oder Hemmung von osteoblastogenesis durch die Bakterien zurückzuführen sein. Zu dem Zeitpunkt geprüft, obwohl die Gesamtzahl der Osteoblasten reduziert wurde, schien es, dass ein größerer Anteil von Rest Osteoblasten stimuliert aktiv Knochen festgelegt werden verglichen mit den Kontrollen, möglich aufgrund einiger kompensatorische Mechanismen als Reaktion auf die bakterielle Herausforderung. Jedoch wurde die Zunahme der Knochenbildung durch die Zunahme der Knochenresorption überwog daher ein Nettoknochenverlust wurde in den infizierten Tieren beobachtet. Es scheint, dass die Reaktion des Alveolarknochens zu diesem parodontalen Erreger kompliziert ist, und weitere Längsknochen histomorphometric Analyse wäre hilfreich, um besser auf die Mechanismus-Krankheit zu entwirren.
In Hinblick darauf, was sind die tatsächlichen intrazelluläre Effekte von P. gingivalis
in Osteoblasten /Osteoklasten, unsere bisherigen in vitro-Studie, dass Invasion von P. gingivalis zeigt
nicht Osteoblasten-Proliferation nicht beeinträchtigt, sondern hemmt ihre Differenzierung und Mineralisierung, die teilweise über eine Hemmung der Differenzierung regulatorischen Transkriptionsfaktoren CBFA-1 und osterix [15 ]. Eine weitere in-vitro-Studie findet zwischen P. gingivalis
Fimbrien und Osteoblasten Integrine alph5beta1 Ergebnisse in Peripherie Kondensation von Aktin und Aktivierung von JNK-Weg in den infizierten Osteoblasten, dass die Bindung [51]. Unsere vorläufigen Osteoblasten-Osteoklasten Kokultur Studie zeigt RANKL erhöht und verringert OPG-Konzentrationen in P. gingivalis
infizierten Cokulturen verglichen mit der Kontrolle, was zu einem viel höheren RANKL /OPG-Ration, die osteoclastogenesis und anschließende Knochenresorption (nicht veröffentlichte Daten) stimulieren kann. Offenbar sind gründlichere Studien erforderlich, zusätzliche Wirt-Pathogen interaktive Moleküle zu identifizieren (Adhäsine, Cytokinen, et al.) In Parodontitis, die Entwicklung neuer therapeutischer Targets zu erleichtern parodontalen Knochenverlust und /oder zu stimulieren Regeneration von Alveolarknochen zu verhindern.
Schlussfolgerungen
Zusammenfassend stellte die Daten zeigen hier, daß P. gingivalis
alveolären Osteoblasten eindringen kann, verursachen eine Abnahme der Osteoblasten, eine Zunahme der Osteoklasten und der Knochenresorption und einen unerwarteten Anstieg in der Knochenbildung in der infizierten Mäusen im Vergleich zu den Kontrollen. Die Knochenresorption schwerer wiegt als die Knochenneubildung daher die infizierten Mäuse zeigen eine insgesamt reduzierte Alveolarknochen Volumen und Dichte. ein besseres Verständnis der pathogenen Mechanismen der Parodontitis, kann an der Entwicklung neuer präventiver oder therapeutischer Strategien gegen diese refraktären Krankheitsverläufen führen
Abkürzungen
P. gingivalis
.
Porphyromonas gingivalis
CFU:
Kolonie bildende Einheit
LPS:
Lipopolysaccharide
< dfn> RANKL:
Rezeptor-Aktivator von nuclear factor-kappaB Ligand
OPG:
Osteoprotegerin
TSBY:
Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.
