Zusammenfassung
Hintergrund
Titanimplantate in der Mundhöhle mit einem Speichel stammenden Häutchen auf die frühen kolonisierenden Mikroorganismen wie Streptococcus oralis bedeckt
binden kann. Die Proteinprofile der Speichel Häutchen auf Titan nicht gut charakterisiert worden und die Proteine von Bedeutung für die Bindung sind daher unbekannt. Biofilm-Bakterien verschiedene Phänotypen von ihren Pendants planktonischen aufweisen und Kontakt mit Speichel-Proteine zur Induktion von Veränderungen in der Physiologie eines Faktors beitragen können. Wir haben Speichel Häutchen gekennzeichnet von Titanoberflächen und untersucht, wie Kontakt mit unbeschichteten und Speichel beschichteten Titanoberflächen metabolische Aktivität in anhaftenden Zellen von S
beeinflusst. oralis
.
Methoden
Speichel- Häutchen auf glatten Titanoberflächen desorbiert wurden und diese, sowie gereinigten menschlichen Speichel, auf zweidimensionale Gelelektrophorese und Massenspektroskopie unterzogen wurden. Es wurde eine Parallelplattenfluss-Zellmodell zu studieren Bindung eines frischen Isolat von S
verwendet. oralis
zu unbeschichteten und Speichel beschichteten Titanoberflächen. Metabolische Aktivität wurde mit der Licht CTC Vitalität Kit und konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie
Bac beurteilt. Die Experimente wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt und die Ergebnisse analysiert Student t
-test oder ANOVA.
Ergebnisse | sekretorischen IgA, α-Amylase und Cystatine wurden als dominante Proteine in den Speichel Häutchen identifiziert. Die selektive Adsorption von Proteinen wurde durch die Anreicherung von Prolaktin-induzierbare Protein und das Fehlen von Zink-α nachgewiesen
2-Glykoprotein in Bezug auf Speichel. Die Einhaltung von S
. oralis
zu Titan zu einer Hochregulation der metabolischen Aktivität in der Bevölkerung nach 2 Stunden geführt. In Gegenwart eines Speichel Häutchen, wurde dieser Effekt verstärkt und nachhaltig über den folgenden Zeitraum von 22 Stunden.
Schlussfolgerungen kaufen Wir, dass die Einhaltung Titan zu glätten gezeigt haben Oberflächen unter Strömung verursacht eine Hochregulation der metabolischen Aktivität in den frühen orale colonizer S
. oralis
, wahrscheinlich als Teil einer Anpassung an die Biofilm-Modus des Lebens. Die Wirkung wurde durch einen Speichelbelag verbesserte enthält sIgA, α-Amylase, Cystatine und Prolaktin-induzierbare Protein, das zum ersten Mal, wie eine reichliche Bestandteil Speichel Häutchen auf Titan identifiziert war. Weitere Studien sind erforderlich, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Wirkung von Oberflächenkontakt auf metabolische Aktivität als auch zu klären, wie die Speichelproteine verantwortlich für die Verbesserung der Wirkung zu identifizieren.
Schlüsselwörter Bakterien Mikrobielle Biofilm Zahnimplantat Streptokokken elektronische ergänzendes Material
Die Online-Version dieses Artikels (doi:. 10 1186 /1472-6831-13-32) enthält zusätzliches Material, das autorisierten Benutzern zur Verfügung
Hintergrund
die menschliche Mundhöhle beherbergt eine große Anzahl von. verschiedene Bakterienspezies, die in komplexen, mehr Spezies Biofilmen zu finden sind. Auf Zähne werden diese Biofilme als Zahnbelag bekannt. Entscheidend für die Entstehung und Entwicklung von Plaque ist die Einhaltung von Pionierarten wie Streptococcus oralis
, Streptococcus mitis
und Streptococcus gordonii
sowie Actinomyces naeslundii
zum Speichelbelag die Mäntel der Zahnoberfläche [1, 2]. Sobald die Biofilmbildung initialisiert wurde und der im Entstehen begriffenen Zahnoberfläche besiedelt, Co-Einhaltung der späteren Kolonisatoren führt zur Bildung von reifen orale Biofilme [3]. Die frühe Entwicklung von Biofilmen auf Zahnimplantate nicht gut charakterisiert worden, aber die Abfolge der mikrobiellen Besiedlung gedacht ist für die Zähne in der gleichen Mundhöhle, die ähnlich zu sein [4, 5].
Zähne und Zahnimplantate, sowie die Schleimhautoberflächen, mit einem Häutchen bedeckt, die eine dünne Schicht aus adsorbierten Proteine hauptsächlich aus Speichel stammen. Pellicle Proteine bieten eine Reihe von potentiellen Rezeptoren für die Befestigung der frühen Kolonisatoren. Eine Kombination von in vivo und in vitro
Studien unter Verwendung von Antikörper-basierte Proteomik und Ansätze hat sich gezeigt, dass die erworbenen Schmelzbelag eine Reihe verschiedener Speichelproteinen einschließlich Lysozym enthält, Histatine, statherins [6], α-Amylase , Cystatine, sekretorischen IgA (sIgA), Lactoferrin und Prolin-reiche Proteine (Prps) [7] sowie die großen Speichel Mucin, MUC5B [8]. Für eine umfassende Zusammenfassung von Proteinen in Schmelz Häutchen nachgewiesen siehe Siquiera et al
. 2012 [9]. Die Zusammensetzung eines anhaftenden Pellicle sowie die Dichte und die Konformation der Proteine, die in es wird allgemein angenommen, die von den physikalisch-chemischen Eigenschaften des Substrats beeinflußt werden, aber bis jetzt noch die Gesamtzusammensetzung der Speichel Häutchen gebildet auf unterschiedlich modifizierten Titanoberflächen sind bekannt. Trotz des Vorhandenseins nur wenige Studien, einige Speichelproteinen einschließlich Cystatine, sIgA, α-Amylase und Prolin-reiche Proteine wurden in der anhaftenden Häutchen gebildet auf Titan in vitro unter Verwendung von Western-Blotting
[10, 11] identifiziert. Doch in allen diesen Studien verwendeten Methoden Speichel als Häutchen zur Verwendung vorzubereiten kann eine große Auswirkung auf die erzielten Ergebnisse. Zum Beispiel, Filterung und Zentrifugiertechniken Hauptpopulationen von Speichelproteinen entfernen kann zur Bildung von Speichel-Häutchen führt, die in vivo
nicht repräsentativ für diejenigen sind.
Die Erkenntnis, dass die mikrobielle Biofilme sind ein wichtiger Faktor, mit dem Versagen von Zahnimplantaten [12] hat zu vielen Untersuchungen von bakteriellen Adhäsion an Titanoberflächen geführt. In vivo
, wenn das Festhalten von Bakterien und Speichel Pellikelbildung parallel auftreten, S
. oralis
und S
. mitis
unter den vorherrschenden frühen Kolonisatoren auf titanbeschichteten Glasoberflächen waren und kein Actinomyces
Spezies gefunden wurden [13]. In-vitro-
wurde sowohl zu erhöhen und verringern die Haftung des frühen Besiedler, S
die Anwesenheit von Speichel auf beiden glatten oder mäßig rauen Oberflächen gezeigt. oralis
, [10, 14], während der A
verbindlich. naeslundii
zu Titan war unbeeinflusst von der Anwesenheit eines Speichel Häutchen [11]. Insgesamt haben die Ergebnisse von Studien der bakteriellen Adhärenz zu Titan in Gegenwart von Speichel kein klares Bild ergeben, und während einige der Unterschiede an den Speichel gesehen zurechenbaren verwendet, Veränderung der Bakterienstämme und die Arten der Titanoberfläche kann auch dazu beitragen, der Mangel an Konsens.
Während Biofilmentwicklung für die Entwicklung von oralen Erkrankungen wichtig ist, ein entscheidender Faktor ist die Physiologie und das Niveau der Aktivität der anhaftenden Bakterien. Bakterien Anpassung an die Biofilm-Modus des Lebens ist bekannt, mit großen Veränderungen in der Transkription und Proteinsynthese [15] in Verbindung gebracht werden. Zum Beispiel offenbart in Porphyromonas gingivalis
Vergleichs transkriptomischen Analyse, dass eine große Anzahl von Genen werden differentiell in Biofilm-Zellen exprimiert, verglichen mit ihren frei schwebenden Gegenstücke [16]. In einer Studie, in Streptococcus mutans
die relative Syntheserate von mindestens 25 verschiedene Proteine wurde innerhalb von 2 Stunden nach der Anbringung an einer Glasoberfläche verbessert. Diese Proteine wurden meist mit Kohlenhydrat Katabolismus assoziiert [17] vorgeschlagen, daß Veränderungen in der metabolischen Aktivität während Adhäsion an Oberflächen auftreten können. Wenig ist derzeit bekannt, jedoch über die Stoffwechsellage von Zellen während der Interaktionen mit Pellikel Proteine in den frühen Stadien der Bildung von Biofilmen. Das Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, wie die Einhaltung der Titanoberflächen wirkt sich auf die metabolische Aktivität des frühen Besiedler S
. oralis Karten und die Wirkung eines Speichelbelag auf diesen Prozess zu bestimmen. Zur Klärung, auf die Speichelproteine Einhaltung und die metabolische Aktivität beeinflussen können, präsentieren die vorherrschenden Proteine in einem Speichelbelag auf Titan gebildet wurden identifiziert.
Methoden
Bakterien und Kulturbedingungen
Ein frisches klinisches Isolat von S
. oralis
(89C) wurde von einem Patienten erhalten mit einer laufenden periimplantären Infektion nach der ethischen Zulassung von der Fakultät für Zahnmedizin erhalten worden war [14]. Bakterien wurden bei 37 ° C über Nacht auf Blutagar in einer Atmosphäre von 5% CO 2 in Luft gezüchtet. Kolonien wurden in 120 ml phosphatgepufferter Salzlösung suspendiert [0,15 M NaCl, 10 mM NaH 2PO 4, pH 7,4 (PBS)] eine OD 600nm = 0,6 zu ergeben. Für die Strömungszellen Experimenten wurde ein gleiches Volumen PBS hinzugefügt, um die Zellkonzentration vor der Biofilmbildung zu halbieren, während der planktonischen Experimenten die ursprüngliche Bakteriensuspension mit einem gleichen Volumen von entweder PBS gemischt, oder 50% ganzen menschlichen Speichel geben eine endgültige Konzentration von 25% Speichel.
Sammlung und Vorbereitung von Whole Speichel
Speichel auf Eis über 1 Stunde von zehn gesunden Personen gesammelt wurde gesammelt und hergestellt, wie zuvor beschrieben [18] nach ethischen Zulassung war von der erhalten worden Fakultät für Zahnmedizin. Kurz gesagt, wurde die Probe mit einem gleichen Volumen von PBS gemischt, bei 4ºC über Nacht leicht gerührt und in einem Beckman-Coulter Avanti JE-Zentrifuge (Beckman JA 20 Rotor; Beckman Coulter, Brea, CA) zentrifugiert (20 Minuten, 30 000 g
, 4 ° C). Der Überstand wurde dann in CsCl /0,1 M NaCl in einem Beckman Coulter Optima LE-80K Ultracentrifuge zu isopycnic Dichtegradienten-Zentrifugation unterzogen (Beckman 50.2 Ti-Rotor, Dichte 1,45 g Ausgangs ml -1) bei 36000 rpm für 90 Stunden bei 15 ° C. Die Fraktionen Bakterien wurden verworfen und die restlichen wurden vereinigt, gegen PBS dialysiert und gelagert bei enthält -. 20 ° C
Titanoberflächen
Die Titanoberflächen in dieser Studie verwendet wurden aus kommerziell reinem Titan Grad IV waren, die glatt war, mit eine mittlere Oberflächenrauhigkeit (S a) von 0,1 um [14]. Die Platten (99 × 25 × 0,8 mm) gedreht wurden, mit Spülmittel gereinigt, mit destilliertem Wasser gespült und unter Verwendung von γ-Bestrahlung (ELOS Pinol A /S) sterilisiert.
Charakterisierung von Speichel Häutchen
Zwei Titanplatten, getrennt durch ein Gummiabstandshalter mit einer Dicke von 1,6 mm wurden in einer Durchflusszelle und die Oberflächen mit 50% Voll menschlichen Speichel über Nacht beschichtet montiert. Nach dieser Zeit wurden die Strömungszellen abgelassen und die Oberflächen gewaschen (2 × 2 min) mit PBS auf eine Schwingplatte. Zum Entfernen der oberflächenassoziierten Häutchen, ein Gemisch aus Tween 80 (0,006 v /v%) und Triton X-100 (0,012 v /v%) wurde eingeführt, und die gesamte Durchflusszelle in ein Ultraschallbad gestellt für 1 Stunde. Der Inhalt wurde dann abgelassen und gesammelt, bevor Sie diesen Schritt für weitere 15 Minuten zu wiederholen. Protein desorbates nach jeder Wäsche gesammelt wurden gesammelt und die Proteinkonzentration bestimmt ein 2D-Quant-Kit (GE Healthcare Life Sciences) mit. Ein Volumen auf 20 & mgr; g Protein entspricht, wurde zu 2DE unterzogen. Kurz gesagt wurde das Desorbates mit Rehydrationspuffer verdünnt und in einer erneuten Anschwellen Kassette mit 18 cm pH 4-7 lineare IPG-Streifen (GE Healthcare Life Sciences) an der Spitze platziert. Rehydration wurde 30 Stunden unter Silikonöl bei Raumtemperatur durchgeführt. Isoelektrische Fokussierung wurde eine Multiphor II durchgeführt (GE Healthcare Life Sciences) mit Kühlwasser bei 15 ° C, geliefert von Pharmacia Multitemp II. Die Fokussierung wurde bei 150 V für 1 Stunde begonnen und bei 300 V für 3 Stunden, 600 V für 3 Stunden, 1200 V für 12 Stunden und schließlich 3,500 V für 20 Stunden. Nach der Fokussierung wurden die IPG-Streifen bei -80 ° C gelagert. Bevor in der zweiten Dimension ausgeführt wird, wurden die IPG-Streifen zunächst 6,8 mit 2% SDS, 26% Glycerin und 16 mM DTT für 15 Minuten in 50 mM Tris-Puffer pH äquilibriert und dann in 50 mM Tris-Puffer pH 6,8, enthaltend 2% SDS, 26 Glycerin%, 250 mM Iodacetamid und 0,005% Bromphenolblau für weitere 15 Minuten. Die äquilibrierten IPG-Streifen wurden auf 14% igen Polyacrylamidgelen eingebettet (20 × 20 × 0,1 cm) unter Verwendung von 0,5% (w /v) Agarose geschmolzen. SDS-PAGE wurde bei einem konstanten Strom von 15 mA Gel durchgeführt -1, 10 ° C, über Nacht in einem PROTEAN II xi Zelle (Bio-Rad) mit Regenbogen im hohen Bereich Molekularmassenstandards (GE Healthcare Life Sciences) laufen auf der sauren Seite der IPG-Streifen. Die Gele wurden mit Coomassie-Brilliantblau oder Silber gefärbt gemäß den Protokollen von GE Healthcare Life Sciences.
Identifizierung von Proteinen, die auf 2D-Gelen mittels LC-MS /MS
Spots von Interesse wurden manuell von Coomassie-Brilliantblau gefärbten 2DE Gelen ausgeschnitten von Gesamtspeichel und LC-MS /MS unterzogen, wie zuvor beschrieben [19]. Kurz gesagt, mit Iodacetamid Proteine wurden mit DTT (60 ° C, 20 Minuten), alkylierte reduziert (25 ° C, 10 Minuten) und dann mit Trypsin (37 ° C, 8 Stunden) verdaut. Tryptischen Peptide wurden getrennt und MS unterzogen. Peptid-Peaks wurden automatisch und Massenlisten in Form von Mascot Generisches Files verwendet als Eingabe für Mascot MS /MS-Ionen sucht der NCBInr Datenbank mit der Matrix Science Web-Server dekonvolutiert (http:. //Www. Matrixscience com) .
Bestimmung der Oberflächenabdeckung und Lebensfähigkeit
in PBS oder 25% Gesamtspeichel suspendierten Zellen Lebensfähigkeit der durch Anfärben einen Tropfen der Suspension mit dem Live /Dead Bac beurteilt
Licht Färbekit (Life Technologies, Stockholm , Schweden) an der Grundlinie (Zeit 0), nach 2 und 24 Stunden und mit einem invertierten konfokalen Laserscanning-Mikroskops (CLSM) (Eklipse TE2000, Nikon Corp.) anzeigen. Die vertikale, parallele Plattenflusszellensystem verwendet wurde zuvor beschrieben (14). Kurz gesagt, S
. oralis
Zellen wurden über zwei Titanoberflächen geführt (99,25 × 25,25 × 0,8 mm), getrennt durch ein 1,6 mm Gummiabstandhalter, der entweder unbeschichtet waren oder über Nacht mit Speichel beschichtet worden. Alle Experimente wurden bei 37 ° C und eine laminare Strömung von 42 ml h durchgeführt -1 verwendet, um die tägliche Speichelfluss über den oralen Oberflächen zu modellieren. Alle Lösungen wurden durch den unteren Einlaß eingeführt und Ausströmen aufgetreten durch das obere Ventil. Anfänglich Oberflächen wurden 30 Minuten lang mit PBS gespült. Die gleiche Bakteriensuspension wurde dann in zwei Durchflusszellen eingebracht; eine zwei unbeschichteten Oberflächen und die anderen, die zwei Speichel beschichteten Oberflächen für 2 oder 24 Stunden bei 37 ° C enthält. Nach dieser Zeit wurden die Strömungs Zellen mit PBS (wie oben) 30 Minuten lang gewaschen lose angebracht Bakterien von den Oberflächen zu entfernen. mit Live /Dead Bac
Leichte Flecken Oberflächenbedeckung und Lebensfähigkeit der oberflächenassoziierten Zellen wurden auf einer der Titanplatten in jeder Flusszelle beurteilt. Die Experimente wurden dreimal mit unabhängigen Bakterienkulturen durchgeführt.
Bestimmung der metabolischen Aktivität
metabolische Aktivität von planktonischen Zellen zu untersuchen, eine aliquote Menge von der gleichen Bakteriensuspension entfernt wurde für die Lebensfähigkeit Messungen verwendet wird, platziert in einem ibidi Durchfluss- Zellkammer und die mit dem Licht CTC Vitalität Kit (Life Technologies, Stockholm, Schweden)
Bac inkubierten Zellen in einer feuchten Kammer bei 37 ° C für 2 Stunden. Die Objektträger wurden dann eine CSLM angesehen werden. Um die Stoffwechselaktivität von adhärierten Zellen, die zweite Titanplatte in jeder Strömungszelle zu untersuchen, wurde mit dem Licht CTC Vitalität Kit
Bac inkubiert wie oben, und die Zellen dann gegengefärbt mit 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol ( DAPI, Life Technologies, Stockholm, Schweden). Gefärbte Zellen wurden eine CSLM sichtbar gemacht werden. Bilder Bildanalyse und Statistik
Für Proben gefärbt mit dem Live /Dead Bac
Licht Färbekit, zehn zufällige Bilder jeweils mit einer Fläche von 127,3 & mgr; m 2 wurden genommen für die Bildanalyse. Die Bilder wurden mit der BioImage analysiert
_L
Softwarepaket die durchschnittliche Oberflächenabdeckung sowie den Anteil von lebenden (grün) und tote (rot) Zellen [20] quantitativ zu bestimmen. Denn mit der Vitalität Kit
Bac gefärbten Proben Licht CTC metabolische Aktivität zu bewerten, wurde die Bildanalyse durch die Beobachtung von mindestens 1000 Zellen und Zählen der Anzahl der metabolisch aktiven Zellen (rot /pink) und nicht-aktiven Zellen (ungefärbten in der ausgeführt Suspensionsproben oder counterstained blau auf den Titan-Oberflächen). Die erhaltenen Ergebnisse wurden unter Verwendung von Student t
-Test ausgewertet zwei Gruppen zu vergleichen oder eine Einweg-ANOVA mit Bonferroni Post-Test drei Gruppen zu vergleichen. Ein Konfidenzintervall von 95% wurde gewählt, und p-Werte unter 0,05 wurden als signifikant angesehen.
Ergebnisse | Biofilmbildung auf Titan in Flusszellen
Der Biofilm-bildenden Fähigkeit von S
. oralis
wurde in einem Fließzellsystem, das zwei unbeschichtete Titanoberflächen untersucht. Bakterienkolonien in PBS dispergiert in strömungs Zellen eingebracht und für 2 bzw. 24 Stunden anhaften gelassen. Nach 24 Stunden wurde die mittlere Flächenbelegung um 60% verringert im Vergleich zu dem nach 2 Stunden vorgeschlagen, einige der Zellen, die über die Zeit zunächst abgelöst anhaftete (Abbildung 1). In der anfänglichen Zellsuspension war das Niveau der Rentabilität hoch wie durch Färbung mit dem Bac
Licht Live /Dead-Kit enthüllt. Nach 2 und 24 Stunden wurde die Lebensfähigkeit der adhärenten Populationen nicht signifikant verschieden zu der der ursprünglichen Suspension, was darauf hinweist, daß zu Titan Bindung beeinflussen nicht nachteilig auf die Zellen. Da Oberflächen in der Mundhöhle mit einem Speichelbelag abgedeckt sind, untersuchten wir die Wirkung von Speichel auf Haftung und Lebensfähigkeit von S
. oralis
. Auf Oberflächen mit 25% Speichel beschichtet, die mittlere Flächenbelegung nach 2 Stunden (178 ± 103 & mgr; m 2) zu derjenigen auf den unbeschichteten Oberflächen gesehen (p = 0,67) (Daten nicht gezeigt) nicht signifikant verschieden war. Wie für die unbeschichteten Flächen nach 24 Stunden die durchschnittliche Oberflächenbedeckung auf dem Speichel coat gesunken war (24,6 ± 7,4 & mgr; m 2), was zeigt, daß auch von diesen Oberflächen im Laufe der Zeit abgelöst Bakterienzellen. Das Niveau der Lebensfähigkeit der Zellen auf dem Speichel beschichtete Oberfläche war nicht signifikant verschieden zu der auf der unbeschichteten Oberfläche auf dem gleichen Zeitpunkt. Abbildung 1 Bilder zeigen die Biofilmbildung von S. oralis auf unbeschichteten Titanoberflächen. Bakterien in PBS suspendiert wurde erlaubt für 2 und 24 Stunden Biofilmen auf Titanoberflächen in einem Parallelplattenflusszellensystem zu bilden. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Live /Dead Bac
Leichte Flecken und Anzeigen mit CSLM bewertet. Oberflächenabdeckung auf den Titanplatten wurde von zehn zufällige Bilder beurteilt unter Verwendung der BioImage
_L
Software-Paket. Die Skalenbalken stellen 10 & mgr; m und die Einsätze zeigen Zellen in zweifacher Vergrößerung. Metabolische Aktivität in Bezug
mit unbeschichteten und Speichel beschichteten Oberflächen
metabolische Aktivität von S
zu kontaktieren. oralis
Zellen wurde unter Verwendung des Licht CTC Vitalität Kit
Bac beurteilt, wo metabolisch aktive Zellen das farblose Tetrazoliumsalz zu einem unlöslichen Formazanprodukts reduzieren wodurch sie rot erscheinen (oder rosa in der Gegenwart des blauen DAPI Gegenfärbung). Zellen aus Blut-Agar bei Zeit entfernt 0 und dispergiert in PBS zeigte ein niedriges Niveau der endogenen Stoffwechselaktivität (6 ± 1,5%) (Abbildung 2). Fortsetzung der Inkubation der Zellen in PBS hatte keine signifikante Wirkung auf der Ebene der Stoffwechselaktivität nach 2 Stunden (4 ± 0,5%) oder 24 Stunden (2 ± 0,1%). Jedoch nach 2 Stunden in der Strömungszellenmodell enthielt die adhärenten Population einen signifikant höheren Anteil an roten Zellen, was anzeigt, dass die Stoffwechselaktivität durch den Kontakt mit einer Oberfläche stimuliert wurde. Nach 24 Stunden war der Grad der metabolischen Aktivität in der adhärenten Population verringert war aber immer noch deutlich höher als in der ursprünglichen PBS-Suspension (p & lt; 0,01). Abbildung 2 Bilder metabolische Aktivität von S. oralis in Suspension und eingehalten werden unbeschichtete Titanoberflächen zeigt. Bakterien in PBS suspendiert wurde erlaubt für 2 und 24 Stunden Biofilmen auf Titanoberflächen in einem Parallelplattenflusszellensystem zu bilden. Die metabolische Aktivität der Zellen wurde unter Verwendung des Licht CTC Vitalität Kit
Bac beurteilt. Für anhaftenden Zellen wurde DAPI als counterstain verwendet. Die Zellen wurden mit CSLM und der Anteil der metabolisch aktiv (rot /pink) Zellen, die durch manuell Zählen mindestens 1000 Zellen bewertet angesehen. Die Skalenbalken stellen 10 & mgr; m und die Einsätze zeigen Zellen in zweifacher Vergrößerung., Die Auswirkungen der Speichelbeschichtung auf die metabolische Aktivität von adhärenten Bakterien wurden dann untersucht. Dies zeigte, dass die Spiegel für Zellen, die mit dem Speichel beschichtete Oberfläche assoziiert waren signifikant höher nach 2 Stunden und 24 Stunden, um die in der ursprünglichen Suspension PBS verglichen (p & lt; 0,001) (Abbildung 3). Inkubation der Bakterien: 25% Speichel in Suspension verursacht keine signifikante Veränderung der Stoffwechselaktivität über 2 Stunden (4 ± 0,5%) oder 24 Stunden (3 ± 0,6%) darauf hinweist, dass die Wirkung war spezifisch für Speichelproteinen auf eine Oberfläche geklebt. Diese Daten zeigen, dass so Speichelproteinen adsorbiert haben die Fähigkeit, eine metabolische Reaktion hervorzurufen, die nicht zu sehen ist, wenn die Proteine in der Lösung vorhanden sind. Abbildung 3 Bilder auf die metabolische Aktivität von S. oralis geklebt Speichel beschichteten Titanoberflächen zeigt. Bakterien in PBS suspendiert wurde erlaubt für 2 und 24 Stunden Biofilmen auf Speichel beschichteten Titanoberflächen in einem Parallelplattenflusszellensystem zu bilden. Die metabolische Aktivität der Zellen wurde unter Verwendung des Licht CTC Vitalität Kit
Bac bewertet mit DAPI als Gegenfärbemittel. Die Zellen wurden mit CSLM und der Anteil der metabolisch aktiv (rot /pink) Zellen, die durch manuell Zählen mindestens 1000 Zellen bewertet angesehen. Die Skalierungsbalken stellen 10 & mgr; m und die Inserts zeigen Zellen in zweifacher Vergrößerung.
Da nicht lebensfähigen Zellen an den Oberflächen keine Stoffwechselaktivität zeigen, erwartet, den Grad der metabolischen Aktivität in Abhängigkeit von der Anzahl der lebensfähigen Zellen zu untersuchen, wurde ein Verhältnis für jeden Zeitpunkt (Tabelle 1) berechnet. Dabei zeigte sich, dass für die suspendierten Zellen in PBS oder Speichel, während die Lebensfähigkeit beibehalten wurde, da der Stoffwechselaktivität im Laufe der Zeit keine signifikanten Veränderungen. Festhalten an einer unbeschichteten Oberfläche verursacht wird, den Anteil der lebensfähigen Zellen, die metabolisch aktiv waren, nach 2 Stunden auf 50% steigen, während die Bindung wesentlich zu einem Speichel Pellicle dieses Niveau auf 98% der lebensfähigen Zellen erhöht (p & lt; 0,001). Während also anfänglichen Kontakt mit einer Oberfläche eine Erhöhung der Stoffwechselaktivität innerhalb der Population verursacht, wurde dies durch die Anwesenheit eines Speichelbelag stark verbessert. Nach 24 Stunden war der Anteil von metabolisch aktiven Zellen auf der unbeschichteten Titan-Oberfläche auf 25% verringert, während auf der Speichel beschichtete Oberfläche der Pegel bei 96% blieb. Dies deutet darauf hin, dass, zusätzlich zu der anfänglichen Reaktion Verbesserung Kontakt Oberfläche die Gegenwart von Speichel-Proteine, die die Erhöhung der Stoffwechselaktivität über 24 hours.Table 1 Anteil der lebensfähigen Bakterien in der Population zeigt metabolische Aktivität unter verschiedenen Bedingungen
Umwelt aufrechterhalten
% lebende Zellen mit metabolischen Aktivität
0 h
2 h
24 h
Die Zellen in PBS suspendiert
6 ± 1,5
4 ± 0,5
2 ± 0,03
Zellen zu unbeschichteten Oberflächen in PBS
geklebt
- 50 ± 4,5
25 ± 2,6
Zellen in 25% suspendiert Speichel
-
4 ± 0,8
3 ± 0,6
Zellen an Oberflächen geklebt, beschichtet mit 25% Speichel
- 98 ± 4,3
96 ± 6,3
Charakterisierung von Speichelbeschichtung auf Titanoberflächen
die wichtigsten Proteinkomponenten in der bakterienfreien Speichel Zubereitung erkennen können, das Material zu 2DE und Proteine mit visualisierten unterworfen wurde durch Anfärben Coomassie-Brilliantblau blau~~POS=HEADCOMP (Abbildung 4a). Dies zeigte die Anwesenheit von mehr als 100 Stellen, von denen die Mehrheit (70) wurden entnommen, und 68 davon mittels LC-MS /MS (Tabelle 2) identifiziert werden konnten. Fast alle Proteine wurden vorliegende gezeigt Speichel Ursprungs sein, mit sekretorischen IgA, Zink-α 2-Glykoprotein, Mitgliedern der Cystatin-Familie, α-Amylase und Prolaktin-induzierte Protein (PIP) als dominierende Spezies in der Vorbereitung. Darüber hinaus Kallikrein, Fettsäure-bindendes Protein und Protein des von Ebner wurden identifiziert. Abbildung 4 2DE-Gelen ganzer Speichel und der Speichelbelag von Titanoberflächen desorbiert. Pooled ganze menschliche Speichel (A) und Speichel Häutchen desorbiert von Titanoberflächen unter Verwendung von Reinigungsmittel (B) wurden einer isoelektrischen unterworfen Fokussierung auf pH 4-7 IPG-Streifen, gefolgt von SDS-PAGE auf 14% Gele. Gele wurden mit Coomassie-Blau (A) oder Silber (B) gefärbt. Spots von Interesse wurden aus dem Coomassie-Gel gepflückt, identifiziert LC-MS /MS verwendet und Identitäten auf das Silber Gel übertragen erkennen. Eine Erläuterung der Etiketten ist in Tabelle 2
Tabelle 2 Identities von Proteinen aus ganzen Speichel oder Speichel Häutchen desorbiert von Titanoberflächen unter Verwendung von Detergens erhalten mittels LC-MS /MS von Flecken aus 2DE Gelen.
Protein Identität gegeben
Punktname
% Sequenzabdeckung
auf der Oberfläche erkannt
-Amylase
amy
45- Ja 55
Calgranulin
cal
49
No
Cystatin
S
cysS
77
Yes
SA
cysSA
37–73
Yes
D
cysD
31
Yes
Fettsäure-bindendes Protein
fab
51
Ja
Immunoglobulin A
J-Kette
IgA /J
37-63
Ja
Schwere Kette
IgA /h
18- 36
Ja
Schwere Kette C-Region
IgA /c
21
No
Sekretorisches component
sec
32–36
Yes
Bur
Bur
11–15
No
Immunoglobulin
Leichte Kette (kappa)
Ig /κ
38-59
Ja
Kallikrein
kal
10
No
Prolactin-induzierbare Protein
pip
63-67
Ja
Von Ebners 's Drüse Protein (Lipocalin)
VEB
27
No
Zink-α-2-Glykoprotein
ZnGP
23-45
No
die Proteine zu identifizieren, die in der Speichelbelag auf Titan gebildet, Flächen wurden über Nacht mit Speichel inkubiert und nach dem Waschen wurden die anhaftenden Proteine mit einem Reinigungsmittel desorbiert und 2DE (4b) unterzogen. Silberfärbung der etwa 50 Flecken zeigte, Gelen, von denen alle in der Coomassie gesehen wurden gefärbt Speichel Gel. Sekretorische IgA, Cystatin Proteine, α-Amylase und PIP waren vorhanden, aber Zink-α 2-Glykoprotein war abwesend darauf hinweist, dass dieses Protein auf der Titanoberfläche nicht haften. Die relative Intensität der PIP-Spots in der Pellicle größer war als in der ursprünglichen Speichel Vorbereitung darauf hindeutet, dass dieses Protein auf der Titanoberfläche angereichert sein könnten.
Discussion Frühe Kolonisatoren wie S
. oralis
Biofilmbildung einleiten, indem sie direkt mit dem Speichelbelag in Wechselwirkung, die auf oralen Flächen vorhanden ist. In dieser Studie haben wir Häutchen von Speichel hergestellt durch Dichtegradienten-Zentrifugation unter nicht-denaturierenden Bedingungen. Der Vorteil dieser Technik ist, dass Speichelbakterien, die pelletiert werden, können aus großen Makromolekülen getrennt werden, wodurch die Herstellung von bakterienfreien, "native" Speichel, in dem auch große Speichelproteinen vorhanden sind. Wir haben zuvor die beiden großen Speichel Mucinen (MUC5B und MUC7) sowie GP340, Lysozym, Lactoferrin, α-Amylase, sekretorisches IgA und Statherin in dieser Zubereitung mittels ELISA [21] identifiziert. In dieser Studie führten wir 2DE in Kombination mit LC-MS /MS unteren Speichelproteine Molekulargewicht (4a) zu identifizieren. Sekretorische IgA war das häufigste Protein, wie durch die Anwesenheit von mehreren Fragmenten ergab (sekretorische Komponente, schwere Kette κ-Kette und J-Kette). In Übereinstimmung mit Analysen von menschlichen Speichel von anderen Gruppen mit Proteomik Ansätze [7, 22] konnten wir auch α-Amylase, Proteine der Cystatin-Familie, Zink-α 2-Glykoprotein und PIP zu identifizieren. Fettsäurebindungsprotein, Kallikrein und von Ebners Drüse Protein (Lipocalin) wurden in geringen Mengen vorhanden. In dieser Studie haben wir die Methode angewandt, um die Speichel Häutchen auf Titan gebildet zu untersuchen. Dies zeigte, dass sIgA und α-Amylase, die am häufigsten vorkommenden Proteine in dem Pellicle zusätzlich zu Mitgliedern der Cystatin-Proteinfamilie und PIP (Bild 4b) waren. Frühere Studien unter Verwendung von SDS-PAGE mit Western-Blot-Analyse kombiniert mit spezifischen Antikörpern gegen Speichelproteine, haben gezeigt, dass α-Amylase gezeigt, sIgA und Prps binden an Titan [10, 11]. Zink-α 2-Glykoprotein wurde von der Pellicle Desorbat abwesend was darauf hindeutet, dass dieses Protein nicht haftet, während die größere relative Abundanz von PIP in dem Desorbat zu Titan als im ursprünglichen Speichelzubereitung zeigt an, dass das Protein an der Oberfläche angereichert ist. Oral Bakterien wie S
. salivarius
, S
. parasanguinis
und S
. oralis
mit PIP [23, 24] in Wechselwirkung treten, was darauf hindeutet, dass dieses Protein bei der Modulation der bakteriellen Besiedelung von oralen Flächen eine wichtige Rolle spielen könnten. Unseres Wissens ist dies das erste Mal, dass PIP wurde als reichlich Protein in Häutchen auf Titan identifiziert. Ein 20 kDa-Protein [25] zu PIP entsprechenden zuvor gezeigt worden, an Hydroxyapatit zu binden, jedoch wurde in der gleichen Weise hier [26] nicht angereichert. Eine Einschränkung dieser Studie ist jedoch, dass es derzeit nicht bekannt ist, ob die Ergebnisse anwendbar sind auf andere Titanoberflächen mit unterschiedlichen Oberflächentopographien oder Oberflächenmodifikationen.
Im Fluss-Zellmodell, S
. oralis
nach 2 Stunden gut Speichel beschichteten Oberflächen geklebt - mit anderen Studien zu primären Kolonisatoren wie Streptococcus anginosus
halten, Streptococcus gordonii
und Streptococcus sanguinis
[10] und Actinomyces naeslundii
[11]. Als Gruppe sind die orale Streptokokken bekannt Adhäsine, die eine Affinität im Speichel [27] für eine Reihe von Proteinen haben auszudrücken. In einer früheren Studie identifizierten wir einen 1060 Aminosäure-enthaltenden, LPXTG-verknüpften Proteins in Stämmen von S
ausgedrückt. oralis
, die gut an Speichel Häutchen gebunden und in silico
Analyse des S
. Alle Autoren haben gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.
