Zusammenfassung
Hintergrund
Eine Reihe von Krankheitserregern im Verlauf der Parodontitis schweren Zerstörung des Zahnhalteapparates führen kann. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Diagnosegerät für den Einsatz am Point-of-Bedarf zum Nachweis von Parodontalpathogenen eine personalisierte Therapie zur Behandlung von Parodontitis zu ermöglichen.
Methoden
Dieses Testsystem basiert auf der Polymerasekettenreaktion von DNA, isoliert aus periodontalen Krankheitserreger und untersucht, um artspezifische Sequenzen auf einem rotierenden Chip mit lyophilisierten Reagenzien für die Polymerasekettenreaktion genau erfassen. Die Erhaltung der Reagenzien optimiert wurde ihre Stabilität während der Lagerung zu gewährleisten.
Ergebnisse In der aktuellen Arbeit
, haben wir ein Modell Point-of-Care-Gerät entwickelt und zeigte ein Proof of Concept. Es erfordert einen geringen Probenvolumen, zeitsparend und kann daher eine frühzeitige Diagnose und Behandlung von Parodontalerkrankungen erleichtern.
Schlussfolgerungen
Das entwickelte Gerät eine schnelle Diagnose der Zusammensetzung und Menge der Patientenmundflora zur Verfügung stellen kann und könnte helfen, die zu beurteilen Stadium der Parodontitis-Infektion. Dies kann eine Optimierung der Therapieansätze erleichtern, um einige der schwerwiegenden Folgen der Krankheit zu verhindern.
Schlüsselwörter Bakterielle Quantifizierung Periodontitis Real-time PCR Mikrobielle Diagnostik Lyophilisation elektronische ergänzendes Material
Die Online-Version dieses Artikel (doi:. 10 1186 /s12903-015-0155-y) enthält zusätzliches Material, das autorisierten Benutzern zur Verfügung
Hintergrund
Etwa 90% der Bevölkerung Erfahrung der Welt Zahn oder mündliche Probleme während ihrer. Leben [1]. 11,2% der Erwachsenen sind durch eine schwere Parodontitis betroffen, so dass es sich um eine relevante Thema in der Zahngesundheitssektor zu machen [2].
Periodontitis ist eine komplexe Entzündungsreaktion des menschlichen Körpers gegen Mikroorganismen, die in zu schweren Gewebezerstörung führen kann der Mundhöhle [3].
Risikofaktoren für Infektionen führen wurden wie Rauchen, Diabetes, Auftreten von speziellen Mikroorganismen, Übergewicht, psychische und hygienische Aspekte identifiziert. Darüber hinaus genetische Faktoren, Alter, Geschlecht und ethnischer Zugehörigkeit auch eine Rolle bei der Entwicklung von Parodontitis spielen könnten [4].
Für die Diagnose von Parodontitis wurden mehrere Verfahren etabliert. Direkte parodontalen Untersuchungen umfassen Patienten Anamnese, Messungen der Taschentiefe und klinische Attachment Sondieren und Zahnröntgenaufnahmen nehmen. Darüber hinaus sind genetische Anfälligkeit Tests oder Prüfung des subgingivalen Mikroflora und Sulkusflüssigkeit optional Methoden Parodontitis zu bewerten [5]. Je nach den Ergebnissen der medizinischen Diagnose und Stadium der Krankheit, folgt eine geeignete Therapie. Ansätze wie die Optimierung der Mundhygiene, regelmäßige professionelle Reinigung, Skalierung /Debridement und Wurzelglättung, die Verwendung von Antibiotika zur Bekämpfung von bakteriellen Plaquebildung und Entzündungen steuern, und im Extremfall sogar Chirurgie kann notwendig sein, Zahnverlust zu verhindern [6].
von den etwa 600 bis 700 Bakterienarten, die in subgingivalen Bereichen leben, nur wenige von ihnen sind mit Parodontitis verbunden und können zu erheblichen Veränderungen in der oralen mikrobiellen Gemeinschaft, Menge und Zusammensetzung führen [7, 8]. Um die Phase der Parodontitis-Infektionen und initiieren wirksame Behandlungen zu beurteilen, ist es hilfreich, sowohl die Identität der wechselwirkenden Spezies zu bestimmen, sowie die Gesamtzahl von Pathogenen in Zahnfleischtaschen zu leben. Die hier vorgestellten Arbeiten konzentriert sich auf Bakterienarten gezeigt mit Parodontitis assoziiert werden, die auf Basis von Pathogenität in drei Klassen abgegrenzt werden können: E. corrodens, F. nucleatum, P. micra
sind leicht pathogen, P. intermedia, C. rectus, E. nodatum Was sind mäßig pathogen und A. actinomycetemcommitans, P. gingivalis, T. denticola
stark pathogenen Organismen [9]. Trotz der Tatsache, dass weitere Arten, die Expression von typischen Biomarker und die individuellen Lebensstil der Menschen, als auch die Entwicklung der Krankheit beeinflussen kann, ist die Detektion dieser Marker Spezies kann ein erster Schritt in dem Prozess sein, eine Krankheit oder die Erkrankung zu identifizieren in mehr Details.
sind die Typen von Bakterienarten in Zahnfleischtaschen lebenden identifiziert werden können, können diese Informationen verwendet werden, um besser auf die Art und Schwere der Infektion und Schneider eine personalisierte Therapie am besten geeignet, um Umkehr seinen Kurs [10] zu klassifizieren.
Nur wenige Point-of Pflegegeräten für die Nukleinsäure-basierte Erkennung bisher auf dem Markt entwickelt und etabliert haben. Cepheid Genexpert zum Beispiel ist ein automatisiertes Gerät für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit speziellen Probenvorbereitungskartuschen für Tuberkulose-Erreger, MRSA oder Streptokokken der Gruppe B. Dies ist jedoch mit hohen Kosten System ermöglicht es nicht, die Möglichkeit, mehrere Multiplex-Reaktionen in einem Testlauf zu implementieren. IQuum präsentierte kürzlich die PCR-driven-Analyse von HIV in 1,5 h mit der LIAT Analysator und Lutz et al.
Zeigte ein Lab-on-a-Foliensystem eine Amplifikationsreaktion für MRSA in weniger als 20 Minuten zu realisieren [11]. Weiterhin Van Oordt et al. [12] im Jahr 2012 über ein integriertes System für die Nukleinsäure-Nachweis oder Immunoassays mit Hilfe einer Einweg-Labdisk Plattform berichtet.
In der vorliegenden Studie wurde die Entwicklung eines einfachen, kostengünstigen Lab-on-Chip zu verwenden, System für die Detektion, Identifizierung und Quantifizierung von parodontalen Bakterien ist die primäre Überlegung bei der Gestaltung des molekularen biologischen Test und Diagnosegerät. Das Diagnosesystem besteht aus zwei Hauptelementen: a mikrofluidische Kartusche, die alle notwendigen PCR-Reagenzien in einem dehydratisierten Format enthält, und eine Hardware-Vorrichtung für Antrieb und zur Steuerung der Arbeitsabläufe. Letzteres ist ein radial geteilt Heizblock Anordnung mehrere stabile Temperaturzonen für die verschiedenen Schritte der PCR in Verbindung mit einem zentral angeordneten Drehmotor enthält, eine Halterung für ein Polycarbonat (PC) PCR-Chip enthält. Dieser Chip birgt die Patientenprobe in Reaktionskammern und dreht sich durch die Temperaturzonen auf dem Heizblock, um die PCR durchzuführen. Die steigende Amplikon Menge kann über Fluoreszenzmessungen nachgewiesen werden.
Konzeptionell ähnliche Rotationsvorrichtungen vorhanden sind, wie der Focus-3M ™ Integrated Cycler, die die Kombination von Zentrifugalkraft verwendet und Infrarotenergie als Wärmequelle für die PCR. Probenanalyse wird entweder in einem wegwerfbaren Universal Disc für Benutzer-Assays oder für bestimmte Krankheiten in einem Chip mit spezifischen Kits erfordern viele Pipettierschritte oder Kühlen von Reagenzien realisiert [13]. Sun et Auch al.
[14] zeigte 2007 eine kreisförmige Mikrochip zur Verstärkung der Anwendung und Ferrofluide magnetischen Kräfte und enthüllt das Problem der geringen Probendurchsatz.
Die Lab-on-a-Chip-basierte Amplifikation und Messsystem vorgestellt in diese Arbeit hat das Potenzial, durch Minimierung Laborhandhabungsschritte konventionelle Parodontitis-Diagnostik in Zukunft zu optimieren und die schnelle Realisierung von PCR ermöglichen, eine lange Lieferzeit von Patientenproben zu vermeiden. Darüber hinaus kann die Chip-basierte Setup in späteren Versionen mit Modulen für die DNA-Isolierung integriert werden. Auf diese Weise wollen wir zeitaufwendige und arbeitsintensive Schritte bei der Probenvorbereitung.
Methoden
Bakterienstämme /Kultivierungsbedingungen /DNA-Isolierung
Parodontose-verursachenden Bakterien wurden erhalten von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen zu beseitigen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) und in geeigneten Medium (siehe Zusatzdatei 1: Tabelle S1) gewachsen. Kolonien oder aus flüssigen Medien durch Zentrifugation pelletiert Bakterien könnten für die DNA-Isolierung abgeholt werden. DNA-Reinigung wurde mit Hilfe des QIAamp DNA Mini Kit ® (Qiagen, Hilden, Deutschland) durchgeführt nach den Anweisungen des Herstellers. DNA-Ausbeute und Reinheit wurden mit dem Nanodrop Instrument 1000 (Thermo Scientific, Wilmington, USA) gemessen.
PCR
Der Nachweis und die Quantifizierung der Verstärkung Parodontalkeime LightCycler 480 II mit durchgeführt. Tabelle S2: Primer-Sequenzen sind in den weiteren Datei 2 angegeben. Die Primer für die Amplifikation der speziesspezifischen DNA-Fragment wurden in diesem Projekt mit Hilfe der Primer3 Software entwickelt. Universal-16S-Primer wurden von Kommedal et al angenommen. [15].
Cycling Bedingungen für die Amplifikation waren wie folgt: 5 Minuten der anfänglichen Inkubation bei 95 ° C, um 40 Zyklen der Amplifikation, gefolgt (95 ° C für 10 s, 51 ° C für 10 s und 72 ° C für 15 s). Nach jedem PCR-Lauf wurde eine zusätzliche Schmelzkurvenanalyse durchgeführt, um die erzeugten DNA-Moleküle zu charakterisieren.
Standardkurven in a wurden zur Einführung von Standardkurven, Verdünnungsreihe von bakterieller DNA im Bereich von 2 bis 2.000.000 Genomäquivalente verwendet
vierfache Versuch für quantitative real-time PCR. Standardkurven wurden standardmäßig mit der Passpunkte Methode des LightCycler-Programm erstellt. Für die Gesamtkeimzahl, Porphyromonas gingivalis
als Vertreter für die 16S-PCR mit einer durchschnittlichen Kopienzahl von vier 16S Genkopien serviert. Der Standard wurde eingerichtet, um eine geschätzte Erreger Zahl zur Quantifizierung zu erreichen. Es ist bekannt, dass mehrere Kopien des 16S-Gens in einem prokaryotischen Genom, mit einem Maximum von 15 Kopien für Bacillus thuringiensis
auftreten kann. Diese Tatsache macht es schwierig, eine realistische Gesamtkeimzahl in einer vielfältigen Bevölkerung von Bakterien zu schätzen, mit stark Kopienzahlen zwischen den einzelnen Spezies variiert. Die Parodontitis verursachenden Organismen in unserer Untersuchung verwendet werden, gemäß den in der ribosomalen RNA-Operon Copy Number Datenbank [16] gegeben, um Informationen in der unteren Kopienzahl Bereich zu sein glaubte. Um dies zu beweisen, die unbekannte Kopienzahl für E. corrodens
im Verlauf dieser Arbeit bestimmt. Für unsequenced Organismen können Kopienzahl-Bestimmung mit Hilfe der Southern-Blot-Analyse erreicht werden. A 16S-Sonde kann die Anzahl der äquivalenten Regionen in der eingeschränkten Genom erkennen, wie zuvor von Lee et al. [17].
Southern-Blot-
Zum 16S-Kopienzahl von E. bestimmen corrodens
über Southern Blot, etwa 10 & mgr; g DNA wurden mit den Restriktionsenzymen Eco RI
HF, Hind
III (New England Biolabs, Ipswich, USA), Nco
I, Pst
I, Xba
I (Jena Bioscience GmbH, Jena, Deutschland) und Xho
I FD (Thermo Fisher Scientific, Waltham, über Nacht USA) bei 37 ° C. Die Proben, zusammen mit dem 16S-PCR-Amplicon als positive Kontrolle wurden bei 4 ° C auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt. Das Gel wurde für die Kapillar-Blot mit Depurinierung (0,25 M HCl), Denaturierung (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH) und Neutralisation hergestellt (3 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl), gefolgt von über Nacht-Blotting auf eine Nylonmembran.
Für die Hybridisierung wurde die Biotin-PCR-Labeling Master (Jena Bioscience, Jena, Deutschland) verwendet, um eine Sonde zu erzeugen. 16S-Primer und Templat-DNA aus E. corrodens
ein biotinyliertes Amplikon durch den Einbau von biotinylierten dUTPs während der PCR zu erzeugen, angewendet wurden. Die Sonde wurde mit dem NucleoSpin® Gel und PCR Clean-up-Kit (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) gereinigt. Um eine vollständige Zielsequenz für die Hybridisierung, eine Untersuchung der möglichen Schnittstellen innerhalb der Sequenz sicherzustellen, wurde durchgeführt: eine enzymatische Inkubation des 16S-Amplikon mit den oben genannten Enzyme und die anschließende Prüfung durch die Band Größe von verdaute Amplikon an die Kontroll-DNA in einer Agarose-Vergleich Gel wurde durchgeführt.
nach Vorhybridisierung über Nacht bei Raumtemperatur einer 2-stündigen Inkubation bei 42 ° C eine Hybridisierung mit 200 ng Sonde /ml Puffer durchgeführt. Die Hybridisierung und das Nachweisverfahren wurden wie in dem Biotin Chromogene Detection Kit (Thermo Scientific, Schwerte, Deutschland), was zu einem farbigen Niederschlag beschrieben durchgeführt.
PCR-on-a-Chip-
Die PCR auf 1 mm Dicke durchgeführt wurde PC-Chips mit Hohlräumen, die ein Volumen von 10 & mgr; l-Reaktionsmischung zu halten. Die Chips wurden versiegelt mit Dichtungsfolien (Nerbe plus GmbH, Winsen /Luhe, Deutschland) von beiden Seiten mit dem PCR-Gemisch eingebettet.
Zur Amplifikation dreht sich die PCR-Chip auf der Thermocyclervorrichtung, die in Fig. 1. Kurz gesagt, wird es von sechs kreisförmig angeordneten tortenstückförmigen Heizblöcke zusammengesetzt, von denen drei zur Durchführung der Denaturierung, Annealing und Verlängerungsschritte und drei weitere Blöcke für die in den Hohlräumen schnelle Temperaturänderungen zu erreichen. Feige. 1 Thermocyclervorrichtung mit unterschiedlichen Temperaturzonen und einem rotierenden PCR-Chip. Links: Eine schematische Zeichnung zeigt die Anordnung der Heizelemente (Ta = Glühtemperatur) und dem Fluoreszenzdetektor. Eine rotierende Chip gibt jede Zone und bei 72 ° C wird das Fluoreszenzsignal gemessen. Das rechte Bild zeigt das Labor Set-up, einschließlich der Antriebsmotor und Temperaturregelung
Für Proof of Concept der Vorrichtung, eine gut etablierte PCR von S. aureus
(ATCC 2592) mit einer Amplicongröße von 279 bp verwendet wurde. Zyklusbedingungen waren eine anfängliche 5 min Denaturierung, gefolgt von 30 s bei jeder der aufeinanderfolgenden 95, 61 und 72 ° C Schritten zur Amplifikation für insgesamt 40 Zyklen mit 5 s auf den Platten zwischen jedem der drei sich verbracht.
die Reaktion mischen sich mit mehreren Additiven, wie in der folgenden 'Lyophilisation Abschnitt' optimiert, um wurde die PCR-Kompatibilität von PC zu erhöhen und Lyophilisation der Mischung zu ermöglichen.
Lyophilisation
Ein Test der zu bestimmen Wirkung der Lyophilisation von PCR-Reagenzien auf der Amplifikationsreaktion wurde mit der E. durchgeführt corrodens
spezifische PCR als gut beschriebenen Testsystem. Das PCR-Gemisch enthielt eine Endkonzentration von 0,25 & mgr; M für jeden Primer, 50% 2x SBYR Grün Mastermix (Roche, Mannheim, Deutschland), 5% Trehalose, 0,25 ug /ul BSA, 0,75% PEG 8000, 10 ng DNA und der Rest ddH
2O. Die Lyophilisierung Mischung wurde 15 min bei -80 ° C eingefroren und schließlich drei Stunden lang in einer vorgekühlten Gefriertrocknungsanlage gefriergetrocknet. Langzeitlagerung bei 4 ° C und der Raumtemperatur bis zu vier Monaten wurden verglichen mit Mischungen vor Licht geschützt, sowohl mit als auch ohne Zugabe von Trehalose-Polymerase Stabilisierung LightCycler System für Echtzeit-PCR. Eine negative Kontrolle wurde während der Lyophilisation laufen jede Verunreinigung während des Verfahrens auszuschließen.
Ergebnisse
