Zusammenfassung
Hintergrund
Die Ziele dieser Studie waren die Immunolokalisation von Ezrin und seine Beziehung mit dem podoplanin Ausdruck in keratozystischen odontogenic Tumoren zu untersuchen. Der
und Methoden
immunhistochemischen Ausdrücke von Ezrin und podoplanin von odontogenic Epithel wurden in keratozystischen odontogene Tumoren mit monoklonalen Antikörpern ausgewertet.
Ergebnisse
Unsere Ergebnisse starke zytoplasmatische Ezrin und membranösen podoplanin Ausdrücke in basalen Epithelschicht aller keratozystischen odontogenic zeigte Tumoren. Die zytoplasmatische und membranöse Ezrin Ausdrücke wurden auch in suprabasal Epithelschichten von Tumoren nachgewiesen. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen zellulären Immun von Ezrin und podoplanin odontogenic Epithel wurden von Wilcoxon-Test (; 0,05 p & lt) gefunden. Keine Korrelation zwischen beiden Proteinen in keratozystischen odontogene Tumoren wurde von Spearman-Test nachgewiesen.
Schlussfolgerungen
Diese Ergebnisse legen nahe, dass Ezrin und podoplanin kann auf die expansive Wachstum und lokale Invasivität von keratozystischen odontogenic Tumoren beitragen. Zusätzlich, da beide Proteine durch odontogenic Epithel überexprimiert wurden, müssen ihre möglichen Rollen weiter bei benignen odontogenen Tumoren erforscht werden.
Schlüsselwörter keratozystischen odontogene Tumor Ezrin Podoplanin elektronische ergänzendes Material
Die Online-Version dieses Artikels (doi . 10 1186 /1472-6831-14-150) enthält zusätzliches Material, das autorisierten Benutzern zur Verfügung
Hintergrund
Podoplanin Expression in Epithelzellen Zahnkeim für die Entwicklung erkannt wurde [1, 2]. und in odontogene Epithel von gutartigen Tumoren [3-10].
die Anwesenheit von podoplanin im menschlichen Zahnkeim Gewebe, erwachsene Zähne und zystischer odontogenic Läsionen vorgeschlagen, dass dieses Protein wahrscheinlich in Mechanismen der Zelladhäsion, epitheliale-mesenchymale Transition beteiligt ist und Invasion und expansive Wachstum von zystischer odontogenic Läsionen [5].
Zurück in unserem Labor durchgeführten Studien untersuchten die Assoziation von podoplanin mit Zellproliferationsaktivität, bestimmt durch Ki-67-Antikörper, in Ameloblastome [7] und keratozystischen odontogene Tumoren [9 ]. Wir hatten keine statistisch signifikante Korrelation in Ameloblastome finden, aber dieser Verein wurde in keratozystischen odontogenic Tumoren beobachtet. Außerdem können sowohl podoplanin und Ki-67 Ausdrücke waren stärker und co-lokalisiert in keratozystischen odontogene Tumoren im Vergleich zu den orthokeratinized odontogene Zysten, einer indolenter Läsion. Diese fingings vorgeschlagen, dass podoplanin positive Zellen in der Zellproliferation Zentrum eine Rolle für dieses Protein in den Prozess der Tumorinvasion angibt, [9].
Weiterhin Friedrich et al. [8] zeigten, dass podoplanin Expressionsmuster zwischen Keratozyste odontogene Tumor diagnostiziert in sporadischen und in nävoide Basalzellkarzinom-Syndrom und die Autoren verstärkt die wahrscheinliche Assoziation dieses Proteins mit einer Invasion und lokale Rezidive des Tumors ähnlich ist.
Neueste Erkenntnisse belegen, dass podoplanin ist wichtig Richtungszellmigration in Epithel- und Tumorzellen [11] zu treiben. Dann wird die Fähigkeit von podoplanin Zytoskelett umzubauen und filipodia artige Membran Verlängerung bilden [12] hat sich als wichtiger Faktor bei der Bewegung odontogener Epithelzellen vorgeschlagen worden [6]. Diese podoplanin-induzierte Zellbeweglichkeit durch von Aktin-Zytoskelett Umlagerung scheint auf die Interaktion mit dem Zytoplasma Ezrin [13], ein Mitglied der ERM (Ezrin, Radixin, moesin) Protein-Proteinfamilie [14, 15] abhängig zu sein.
Die derzeit Studie wurde entwickelt, um die Immun von Ezrin und seine Beziehung mit podoplanin Ausdruck in keratozystischen odontogenic Tumoren zu analysieren. Um das Beste aus unserem Wissen ist dies der erste Bericht von Ezrin Immunfärbung in einem odontogener Tumor.
Methoden
Patienten und Tumorproben
Alle chirurgischen Proben von keratozystischen odontogenic in dieser Studie analysierten Tumor vom Labor erhalten wurden, für Pathologie, Bauru School of Dentistry, Universität von São Paulo, zwischen 2002 und 2010. die Einschlusskriterien waren: i) der Patienten mit der Diagnose von keratozystischen odontogener Tumor auf der Klassifikation der durch die Summe der ermittelten Weltgesundheitsorganisation basiert [16], die klinischen, röntgenologischen und mikroskopischen Daten; ii) die Verfügbarkeit des Paraffinblock mit einer ausreichenden und repräsentativen Menge an odontogener Tumor für die mikroskopische Analyse. Die Anwendung der Einschlusskriterien, 18 keratozystischen odontogenic Tumoren wurden für die Untersuchung von podoplanin und Ezrin Immunfärbung ausgewählt. Diese Studie wurde von der Forschungsethikkommission der Bauru School of Dentistry, Universität von São Paulo (Prozess # 85612/2012) zugelassen.
Immunhistochemie
Formalin-fixierte 3 um Abschnitte von keratozystischen odontogene Tumoren, die aus der Pathologie erhalten Archiv für die Immunhistochemie Analyse der Ezrin und podoplanin Ausdrücke von odontogenic Epithel. Nach Antigen-Retrieval 10 mM Citratpuffer, pH 6,0, in einem inländischen Dampfkochtopf (Modell Eterna 4½ L; Nigro, Araraquara, Brasilien) für 4 min wurde die endogene Peroxidase-Aktivität durch Inkubation in 3% H
2 O 2 für 20 min. 200 oder anti-: Verdünnung 1; Jeder Abschnitt wurde über Nacht bei 48 ° C mit dem primären monoklonalen anti-podoplanin Antikörper (Dako North America, Inc., Carpinteria, CA, USA D2-40 Klon, code # 3619-1) inkubiert Ezrin-Antikörper (Dako North America, Inc., CA, USA), Verdünnung 1: 1000 in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit Rinderserumalbumin (Kat. # A2153, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) Lösung eine nicht-spezifische Reaktion zu blockieren. Dann wurde jeder Abschnitt mit Advance-HRP-Link-System inkubiert (Kat. # 4067, Dako Nordamerika, Carpinteria, CA, USA) für 30 min bei 37 ° C. Beide Antikörper wurden 3,30-diaminobenzedine Tetrahydro erfasst mit (DAB, Kat. # D-5637, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Tumorschnitte wurden mit Mayers Hämatoxylin gegengefärbt, bevor dehydriert und Abdeckung gerutscht. Tonsillen und Darm wurden als positive Kontrolle für podoplanin und Ezrin, verwendet wurden. Für eine negative Kontrolle wurde der primäre Antikörper während der immunhistochemischen Färbung weggelassen. zu einem Lichtmikroskop befestigt und aufgenommen von Software AxioVision (Axiovision 4.7; Die Ezrin und podoplanin Ausdrücke durch odontogenic Epithel der 18 keratozystischen odontogene Tumoren wurden digital mit Hilfe eines Axiocam Kamera (Zeiss, Jena, Deutschland Axiocam MR3) erfasst in zehn mikroskopische Felder ausgewertet; Zeiss). Eine Punktzahl für Ezrin und podoplanin Immunfärbungen von odontogenic Epithel exprimiert wurde auf Basis von: a) die Intensität der Immunfärbung in den epithelialen odontogenen Zellen (0 = nicht vorhanden, 1 = schwach, 2 = mittel, 3 = stark, und 4 = sehr stark) und (b) der Prozentsatz der positiven Zellen odontogene (0 = 0% positive Zellen, 1 = & lt; 25% positive Zellen, 2 = 25-50% positive Zellen, 3 = 50-75% positive Zellen, und 4 = & gt; 75% positive Zellen). Die endgültige Immunofärbung Score wurde durch die Summe von (a) + (b) bestimmt. Endergebnisse lagen im Bereich von 0 bis 8 (0 = abwesend, 1-4 = schwach, und 5-8 = stark). Der Unterschied und die Korrelation zwischen membranartige oder Cytoplasmaexpression von Ezrin und podoplanin ausgedrückt in keratozystischen odontogene Tumoren wurden durch Wilcoxon-Test und Spearman-Korrelationskoeffizient bestimmt sind. Das Signifikanzniveau wurde auf 5% für alle Tests eingestellt.
Ergebnisse
Klinische Merkmale
Unsere Probe in sechzehn Patienten bestand mit keratozystischen odontogenic Tumoren diagnostiziert (neun von ihnen waren Frauen und sieben Männer). Alter des Patienten 9-68 Jahre alt reichte (28 Jahre bedeuten), und sie waren überwiegend weiß (75%). Die meisten der Tumore wurden am Zahnbereich des Unterkiefers (62,5%) liegt, gefolgt von der Maxilla (25%) und in 3 Fällen die Lokalisierung wurde nicht durch den Chirurgen festgelegt. Von den insgesamt 16 Patienten mit keratozystischen odontogene Tumoren, 4 von ihnen hatten Gorlin-Goltz-Syndrom und von diesen, 2 multiple Läsionen hatten, aber in verschiedenen Einheimischen und Perioden.
Podoplanin Ausdruck von keratozystischen odontogenic Tumoren
Die Basalschicht die normale Mundschleimhaut dargestellt Positivität für membranöse podoplanin sowie die Lymphgefäße in die darunterliegende Bindegewebe, die Integrität der immunhistochemische Reaktion bestätigt. Die membranöse und zytoplasmatische Expression von podoplanin wurde an der Basalschicht des Epithels in allen keratozystischen odontogene Tumoren (Tabelle 1) intensiv eingeengt. Die oberen Schichten des Epithels waren negativ für dieses Protein (Abbildung 1) und peripheren Zellen von Tochterzysten stark dieses protein.Table 1 Membranous und Cytoplasma podoplanin Expression in 18 keratozystischen odontogene Tumoren exprimiert
podoplanin
Membranous
Zytoplasmatischen
p *
N
%
N
%
Absent
0
0
0
0
1.000
Schwach
0
0
1
5,56
Strong
18
100
17
94.44
TOTAL
18
100
18
100
Bauru School of Dentistry - Universität von São Paulo, São Paulo, 2002 bis 2010
* Wilcoxon-Test; ρ = statistische Signifikanzniveau von 0,05.
1 Expression von podoplanin in keratozystischen odontogener Tumor Abbildung. Positivität auf der basalen Schicht beschränkt (IHQ, 400 ×).
Ezrin Expression von keratozystischen odontogenic Tumoren
Ezrin wurde in der Cytoplasmamembran der stacheligen Schicht normaler Mundschleimhaut stark exprimiert. Die meisten Keratozyste odontogenic Tumoren epithelialen Zellen (83,33% der Fälle) ausgedrückt stark zytoplasmatischen Ezrin (Tabelle 2). Die zytoplasmatische Ezrin wurde in epithelialen basalen Schicht und höher membranöse Ezrin Positivität könnte bemerkt werden, in über basalen Schichten des Epithels häufig nachgewiesen. Die fehlende oder schwache membranöse Ezrin Expression durch epitheliale Zellen wurde in ca. 61% der Tumoren beobachtet. Die odontogenic Epithelzellen Tochterzysten zeigten auch zytoplasmatische und membranöse Ezrin (Abbildung 2) .Tabelle 2 Membranous und Cytoplasma Ezrin Expression in 18 keratozystischen odontogene Tumoren
Ezrin
Membranous
Zytoplasmatischen
p *
N
%
N
%
Absent
10
55.56
2
11.11
0,007 Schwache
1
5,56
1
5,56
Strong
7
38.88
15
83.33
TOTAL
18
100
18
100
Bauru School of Dentistry - Universität von São Paulo, São Paulo, 2002 bis 2010
* Wilcoxon-Test; ρ = statistische Signifikanzniveau von 0,05.
2 Expression von Ezrin in keratozystischen odontogene Tumor Abbildung. Hinweis zytoplasmatische Positivität in basale und supra basalen Schichten und membranöse Expression in der oberflächlichsten Ebene des odontogenic Epithel (IHQ, 400 ×).
Beziehung zwischen Ezrin und podoplanin Ausdrücke in keratozystischen odontogene Tumoren
Die Test des Wilcoxon verwendet wurde die subzelluläre Expression von Ezrin und podoplanin bei benignen odontogenen Tumoren zu vergleichen. Die Unterschiede zwischen membranöse Ezrin und membranösen (p = 0,003) oder zytoplasmatischen (p = 0,003) podoplanin Ausdrücke waren statistisch signifikant (Tabelle 3). Darüber hinaus gab es keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den zytoplasmatischen Ezrin und membranösen (p = 0,109) oder zytoplasmatischen (p = 0,201) podoplanin Ausdrücke, wie llustrated in Tabelle 3. Der Spearman-Test keine statistisch signifikante Korrelation zwischen membranöse oder zytoplasmatischen podoplanin demonstrieren und Ezrin Ausdrücke in keratozystischen odontogene Tumoren (Tabelle 4) .Tabelle 3: Vergleich zwischen membranöse und Cytoplasma podoplanin und Ezrin Expression in 18 keratozystischen odontogene Tumoren
Podoplanin
Ezrin
M (%)
C (%)
M (%)
C (%)
M PO
M PO
C PO
C PO
X
X
X
X
M EZ
C EZ
M EZ
C EZ
Absent
0
0
55.56
11.11
p = 0,003
p = 0,109
p = 0,003
p = 0,201
Schwache
0
5,56
5,56
5,56
Strong
100
94.44
38.88
83.33
TOTAL
100
100
100
100
Bauru School of Dentistry - Universität von São Paulo, São Paulo, 2002 bis 2010
Wilcoxon-Test; ρ = statistische Signifikanzniveau von 0,05. PO: podoplanin; EZ: Ezrin; M: Membranous; C:. Zytoplasmatischen
Tabelle 4 Membranous und Cytoplasma Korrelation zwischen podoplanin und Ezrin Expression in 18 keratozystischen odontogene Tumoren
Membranous
Zytoplasmatischen
Podoplanin
Podoplanin
Membranous Ezrin
r = 0,000
r = -0,293
p = 1,000
p = 0,293
Zytoplasmatischen Ezrin
r = 0,000
r = -0,108
p = 1,000
p = 0,670
Bauru School of Dentistry - Universität von São Paulo, São Paulo, 2002 bis 2010
r = Spearman-Rangkorrelationskoeffizient; ρ = statistische Signifikanzniveau von 0,05.
Diskussion
In den letzten Jahren hat das Interesse an podoplanin Expression in benignen odontogenen Tumoren deutlich erhöht [3, 4, 6-10, 17]. Es wurde vorgeschlagen, dass dieses Protein in der Bewegung der odontogene Epithelzellen durch Aktin-Zytoskelett beteiligt Umlagerung [6, 9]. Obwohl die odontogene durch podoplanin induzierte Zellmotilität auf seine Wechselwirkung mit der aktivierten Ezrin abhängig sein kann, ist die Verbindung zwischen den beiden Proteinen nicht zuvor in odontogene Tumoren untersucht. Die Ergebnisse in Bezug auf die Immunlokalisation von podoplanin
zeigte starke membranöse und zytoplasmatische Ausdrücke das nachzuweisende Protein hauptsächlich in der Basalschicht des odontogene Epithel, auch in Tochter Zysten. In normalen Mundschleimhaut war podoplanin Ausdruck membranöse und an der basalen Epithelschicht konzentriert. Unsere Ergebnisse bestätigt denen früherer Autoren [4, 8-10, 17].
Da Okamoto et al [4] vorgeschlagen wird, zum ersten Mal eine mögliche Rolle des podoplanin in Tumor Invasivität keratozystischen odontogene Tumoren, weiter Untersuchungen wurden zu verstehen, um die genaue Funktion dieses Proteins in der Pathogenese und das Wachstum dieser gutartigen Tumoren [5, 8-10, 17] durchgeführt. Tsuneki et al. [17] überprüft, dass podoplanin positive Zellen in dem zellularen proliferative Zentrum keratozystischen odontogene Tumoren liegen darauf hindeutet, dass dieses Protein wirkt als einer der wichtigsten Regulatoren im proliferative Prozess dieses Tumors. In ähnlicher Weise wurde die Beteiligung von podoplanin in lokalen Invasion odontogener Tumoren durch unsere bisherigen Erkenntnisse verstärkt [9]. Wir haben die Korrelation zwischen dem podoplanin Expression und der zellulären Proliferationsindex in keratozystischen odontogene Tumoren [9] gezeigt. Weiterhin ist eine interessante Studie von Zhang et al [10] zeigten, dass in keratozystischen odontogene Tumoren, konservativ durch Dekompression behandelt, gibt es einen signifikanten Verlust oder Verringerung der podoplanin Expression im odontogenic Epithel war. In radicular und folicullar Zysten, Zustin et al [5] gefunden podoplanin Ausdruck homogener, im Zytoplasma verteilt und Membran, in epithelialen basale und parabasalen Schicht. Als podoplanin mit anderen Proteinen beteiligt bei der Zellproliferation und Tumorinvasion korreliert ist [9, 17], so kann seine Herunterregulierung nach dem chirurgischen Ansatz begrenzte Aktivität des odontogene Epithel zurückzuführen sein [10]. Trotz der Tatsache, dass die
genaue Funktion von podoplanin in odontogenic Tumoren schlecht verstanden und weitgehend unbekannt, die Ergebnisse der vorliegenden Studie zusammen mit unseren früheren Untersuchung [9] entnommen und die anderer Autoren [5, 17, 8, 10] legen nahe, dass dieses Protein in lokalen beteiligt ist Invasion und in der expansiven Wachstum von keratozystischen odontogenic Tumoren, wahrscheinlich die odontogenic epithelialen Zytoskelett-Aktivität orchestriert.
ein möglicher Mechanismus vorgeschlagen, dass podoplanin bindet Ezrin und als nachgeschalteter, folgt die Phosphorylierung von GTPase-RhoA [7]. Dieser Signalweg würde die Umlagerung des Aktin-Zytoskelett fördern und die Bildung von Filopodien artigen Vorsprüngen, die Förderung der zellulären Bewegung [13] zu induzieren. Also, um zu überprüfen, ob podoplanin und Ezrin sind kolokalisiert in keratozystischen odontogenic Tumoren, wurde die vorliegende Studie entwickelt.
Ezrin, ein ERM-Protein Familienmitglied übt Ur-Funktionen im Zusammenhang mit der Regulierung der zellulären Bewegung und Struktur von transduzierenden Signale zwischen der Plasmamembran und die Aktin-Zytoskelett [14]. Ezrin physiologischen essentiell für viele zelluläre Prozesse einschließlich der Regulierung der Aktin-Zytoskelett ist, die Aufrechterhaltung der Zellform, Adhäsion, Motilität und die Modulation der Signalübertragungswege [14]. Im Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinome
wurde Ezrin als Schlüsselmolekül identifiziert in der Tumorprogression und metastatische Verhalten von Tumorzellen und es wurde mit schlechten Ergebnis korreliert worden [18-21], Podoplanin ähnlich [22]. Um jedoch die bestem Wissen ist dies die erste Hinweise darauf, dass die immunoexpression von Ezrin in gutartigen keratozystischen odontogenic Tumoren bestätigt., Die Ergebnisse hier zeigte Abwesenheit von membranösen Ezrin in 55,56% der keratozystischen odontogene Tumoren präsentiert und, wenn vorhanden, Dieses Protein wurde im Wesentlichen in der Membran der nicht-proliferative supra basalen Schichten (Abbildung 2) beobachtet. Aus, dass wir diese Ezrin hypothesize die Zelladhäsion zu fördern, wie es in ähnlicher Weise beobachtet, in nicht-proliferierenden Zellen Plattenepithelkarzinom der normalen menschlichen Mundschleimhaut [18, 20, 21].
Weiterhin sind die meisten der odontogene Tumoren können sein (83.33% ) zeigten eine starke zytoplasmatische Ezrin Expression besonders in der basalen Schicht odontogener Epithel. Interessanterweise zeigt die zytoplasmatische Ezrin seiner aktivierten [18, 20, 21] und Form, in Mundkrebs, dieses Muster von cytoplasmatischen Ezrin ist mit invasiven Phänotyp und aggressiveres Verhalten maligner Zellen [18-21] in Verbindung gebracht worden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass aktivierte Ezrin für die Vermehrung notwendig ist, und /oder Invasion odontogener Zellen einmal seine zytoplasmatische Positivität hauptsächlich in den basalen Schichten von keratozystischen odontogenic Tumoren gefunden wurde, der Region verantwortlich für das Tumorwachstum.
Die Verteilung von Ezrin in odontogene keratozystischen Tumoren war heterogener als die podoplanin (Tabellen 1 und 2) und statistisch signifikanten Unterschiede wurden zwischen der Lokalisierung von membranösen Ezrin und zytoplasmatische oder membranöse podoplanin (Tabelle 3) beobachtet. Es wurde zuvor berichtet, dass Ezrin in Gegenwart podoplanin Überexpression stark phosphoryliert ist [13]. Diese Wechselwirkung von podoplanin und Ezrin ist verantwortlich für viele der Auswirkungen auf das Zytoskelett, was zu erhöhten Zellbeweglichkeit beitragen [13]. Darüber hinaus gibt es Hinweise darauf, dass ERM Funktion des Zytoskeletts bei der Organisation wird durch seine Fähigkeit vermittelt Aktin zu binden und GTPase-RhoA Phosphorylierung [13] zu regulieren. Interessanterweise stellten die keratozystischen odontogenic Tumoren starke membranöse podoplanin und Cytoplasma Ezrin Expression, die auf die aktivierten Formen beider Proteine entsprechen. Die podoplanin aktivierte Form (membranöse) wurde vor allem in der basalen Schicht gefunden, eine Co-Lokalisation von aktiven Ezrin und aktiv-podoplanin in den hochaktiven Bereichen keratozystischen odontogenic Tumoren anzeigt. Allerdings ist diese Korrelation nicht statistisch signifikant war wahrscheinlich auf die geringe Anzahl von negativen Tumoren (0 für membranöse podoplanin und 2 für zytoplasmatische Ezrin) wegen, die nicht auf die Schaffung eines assoziativen Beziehung zulässt (Tabelle 4).
Schlussfolgerungen
Zusammenfassend berichten wir zunächst, dass Ezrin starke membranöse Expression in der supra basalen Schicht und starke Cytoplasmaexpression in der basalen Schicht aus keratozystischen odontogenic Tumoren präsentiert. So schlägt unsere Untersuchung eine Rolle für Ezrin und podoplanin in keratozystischen odontogenic Tumoren und deren molekularen Wechselwirkungen müssen weiter in dieser Art von Tumoren erforscht werden.
Zustimmung
Diese Studie wurde vom Ausschuss für Ethik und Forschung genehmigt von Bauru School of Dentistry - Universität von São Paulo. CAAE. # 03924312.0.0000.5417
Abkürzungen
ERM:
Ezrin, Radixin und moesin
GTP-ase:
Guanosin triphosphatase.
Erklärungen
Danksagung
Wir möchten die Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Zuschüsse # 2012 /13411-6 und # 2013 /16999-7) und anzuerkennen, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico für die Unterstützung dieser Studie.
Autoren Original vorgelegt Dateien für Bilder
Im Folgenden sind die Links zu den Autoren ursprünglich eingereichten Dateien für Bilder. 12903_2014_474_MOESM1_ESM.tif Autoren Originaldatei für Abbildung 1 12903_2014_474_MOESM2_ESM.tif Autoren Originaldatei für Abbildung 2 Konkurrierende Interessen
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Beiträge der Autoren
ODT zur Konzeption beigetragen und Design dieses Projektes kritische Interpretation von Daten und kritisch das Manuskript zu revidieren. DSLP durchgeführt Erfassung, Analyse und Interpretation Daten. AA trugen mit Datenanalyse, Erstellung und Einreichung des Manuskripts. TKC entwarf auch das Projekt trug mit Erfassung, Analyse von Daten und die Überarbeitung des Manuskripts. NS trug zur Gestaltung des Projekts und auch mit immunhistochemischen Profile für diese Studie. LJRP trugen mit dem Studiendesign, statistische kritische Analyse und Interpretation Daten. SFA vorgesehen Hilfs Infrastruktur notwendig, die Studie durchzuführen und dazu beigetragen, die Konzeption und Gestaltung des Projekts. Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.
