Zusammenfassung
Hintergrund
Ein Schlüsselelement für die langfristigen Erfolg von Zahnimplantaten ist die Integration der Implantatoberfläche mit den umgebenden Wirtsgewebe. Modifikation von Titanimplantatoberflächen können die Aktivität der Osteoblasten verbessern, sondern ihre Auswirkungen auf die Weichgewebezellen sind unklar. Die Einhaltung von humanen Keratinozyten und Gingivafibroblasten zu steuern Reintitan (CpTi) und zwei durch anodische Oxidation hergestellten Oberflächen wurde daher untersucht. Da Implantatabutments zu einer bakterienreichen Umgebung ausgesetzt sind, in vivo
wurde die Wirkung von oralen Bakterien auf Keratinozyten Haftung ebenfalls bewertet.
Methoden
Die Oberflächen wurden mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM) charakterisiert. Die Anzahl der anhaftenden Zellen und Bindungsstärke sowie Vitalität von Fibroblasten und Keratinozyten wurden nach mit Live /Dead Bac
Licht Färbung mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie untersucht. Um die Wirkung von Bakterien auf die Einhaltung und Vitalität zu bewerten, wurden Keratinozyten co-kultiviert mit einem Vier-Spezies-Streptokokken-Konsortium.
Ergebnisse | SEM-Analyse zeigte die beiden anodisierte Oberflächen nanostrukturierte mit unterschiedlichen Graden von poren sein Dichte. Über 24 Stunden, eingehalten beide Fibroblasten und Keratinozyten gut auf die nanostrukturierte Oberflächen, wenn auch in etwas geringerem Maße als an CpTi (Bereich 42-89% der Ebenen auf CpTi). Die Stärke der Keratinozyten-Haftung war größer als die von den Fibroblasten, aber keine Unterschiede in der Haftfestigkeit könnte zwischen den beiden nanostrukturierte Oberflächen und die CpTi beobachtet werden. Das Konsortium kommensaler Streptokokken deutlich reduziert Keratinozyten Haftung auf allen Oberflächen sowie die Integrität der Membran der anhaftenden Zellen zu beeinträchtigen.
Fazit
Sowohl die Vitalität und das Niveau der Einhaltung von Weichgewebezellen auf die nanostrukturierte Oberflächen war ähnlich wie auf CpTi. Co-Kultur mit Streptokokken reduziert die Anzahl der Keratinozyten auf allen Oberflächen auf etwa dem gleichen Niveau und Zellschäden verursacht, dass die kommensalen Bakterien was darauf hindeutet, das Anhaften von Weichgewebezellen beeinflussen könnten, zu Stoßflächen in vivo
.
Schlüsselwörter
Oral Keratinozyten Gingivafibroblasten Zellanheftung Zahnimplantat Oberflächenmodifikation Oral Bakterien elektronische ergänzendes Material
die Online-Version dieses Artikels (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-75) enthält zusätzliches Material, das zur Verfügung steht autorisierten Benutzern.
Hintergrund
Aufgrund ihrer im allgemeinen gute klinische Ergebnisse, sind Zahnimplantate jetzt eine gemeinsame Behandlung für den Ersatz von verlorenen oder fehlende Zähne. Die Schlüsselelemente für den langfristigen Erfolg solcher Implantate sind die Ausbildung einer stabilen Verbindung zwischen dem Host Knochengewebe und der Vorrichtungsfläche (Osseointegration) und Integration der transmukosalen Komponente oder Widerlager, mit den weichen Geweben. Zuvor hat viel Forschung auf die Optimierung der Osseointegration konzentriert, aber in jüngster Zeit hat sich der Schwerpunkt verschoben, um die Entwicklung von Biomaterialien zu enthalten, die die Bildung eines periimplantären Weichgewebebarriere zu verbessern. In der Mundhöhle durch die Schleimhaut Implantatabutments vorstehen, zu einer komplexen Umgebung ausgesetzt enthaltenden Speichel und gingival Exsudat sowie Mikroorganismen. Die mikrobielle Belastung in der Mundhöhle sehr hoch ist und bis zu 700 verschiedene Arten identifiziert wurden [1]. Nach der Plazierung, schnell durch orale Bakterien die Anlagefläche besiedelt wird, die mit epithelialen und Bindegewebszellen zur Bindung an die Oberfläche (für eine Übersicht siehe [2]) konkurrieren kann. Typische Beispiele der frühen Kolonisatoren auf beiden Hart- und Weichgewebe in der Mundhöhle sind Streptokokken, einschließlich Streptococcus gordonii
, Streptococcus oralis
, Streptococcus mitis
und Streptococcus sanguinis
sowie Arten wie Actinomyces naeslundii
[3, 4]. Die Einhaltung dieser Mikroorganismen zur Anlagefläche für einen neuen Satz von Kolonisatoren Bindungsstellen liefern schließlich zur Bildung von reifen Plaque führen [5, 6].
Natürlichen Zähnen bakterielle Invasion in die parodontalen Weichgewebe begrenzt physikalisch von der gingivalen Schleimhaut, die um den Hals des Zahns eine Dichtung bildet. Das Epithel wirkt auch als physiologische Barriere durch die Freisetzung von Molekülen in der angeborenen Immunität, einschließlich antimikrobieller Peptide und Zytokine beteiligt sind, sowie die Einleitung von Entzündungsreaktionen [7]. Im Falle von Zahnimplantaten aus die natürliche Barriere des Saumepithels und das Desmodont fehlt, also die Bedeutung eines Weichgewebemanschette von Epithelzellen und Fibroblasten dicht an den Anschlag zu erhöhen. Studien bei Hunden haben die periimplantären Mukosa vorgeschlagen, eine Dichtung durch eine Manschette gut verhornte Schleimhaut wurden in enger identifiziert, analog zu der umgebenden natürlichen Zähne [8] und Schichten von Epithelzellen Assoziation zu Titanoberflächen implantiert in die Mund bilden können mucosa [9]. Außerdem zeigen histologische Untersuchungen, dass Epithelzellen Titanoberflächen durch hemi-Desmosomen ähnlich denen in den internen Basallamina [10] gefunden befestigen. Die Anordnung von Weichgewebe an der Schleimhautoberfläche wurde durch Modifikation von Titanimplantat Oberflächentopographie mit Oxidation oder Säureätzen, sowie chemische Modifikation mit Laminin 5 [11, 12] gezeigt beeinflusst werden. Vor kurzem hat die Rolle von Nanostrukturen auf Titanimplantatoberflächen in Gewebeheilung ein wichtiger Schwerpunkt des Interesses gerückt. Nanostrukturen, einschließlich nanopores und nanotubues, kann durch anodische Oxidation, eine elektrochemische Verfahren, bei dem Größen wie Spannung, Elektrolytkonzentration und der Zeit erstellt werden können variiert werden, um verschiedene Nanotopographien zu schaffen. Während jedoch die Auswirkungen von Änderungen auf der Nanometer-Ebene auf die Aktivität der Osteoblasten intensiv untersucht wurden [13, 14], Wissen, wie Nanostrukturen beeinflussen periimplantären Weichgewebeheilung ist derzeit begrenzt. Die wenigen in vivo
Studien, die an Ratten durchgeführt wurden [15], Hunde [16] oder Menschen [17] (Wennerberg et al.
) Deuten darauf hin, dass die Verwendung von nanostrukturierten Titan Anschlagflächen könnten Weichgewebe verbessern Heilung. Eine In-vitro-Studie von
Zile et al
. [18] zeigten, dass die Dichte der Keratinozyten auf nanotubulären und nanorough Oberflächen erhöht wurde auf herkömmliche Titanoberflächen Vergleich zu derjenigen während für Fibroblasten wurden solche Studien durch anodische Oxidation [19] Zelladhärenz auf, aber die Einhaltung verringert hergestellt nanostrukturierte Oberflächen vergrößert dargestellt nano-strukturierten Titanbeschichtungen auf Silikon [20]. Während diese in vitro Studien
Licht auf mögliche positive Effekte solcher Oberflächen vergossen haben, in vivo
ist die Situation in der Anfangsphase der Heilung viel komplexer, wo die Zellbindung in Gegenwart von frühen Kolonisations oralen Bakterien auftritt wie orale Streptokokken. Daher in dieser Studie haben wir die Adhärenz von humanen Keratinozyten und gingivale Fibroblasten nanostrukturierten Titanoberflächen untersucht und bewertet auch die Wirkung eines bakteriellen Konsortiums Streptococcus gordonii
enthält, Streptococcus oralis
, Streptococcus mitis
und Streptococcus sanguinis
Haftung von Keratinocyten an die Oberflächen.
methods
Titanoberflächen
Titanium Scheiben (8 mm Durchmesser und 2 mm Dicke) mit drei verschiedenen Oberflächen in dieser Studie verwendet wurden. Reintitan Scheiben (CpTi) wurden als Kontrollen (C) und zwei anodisch oxidierte Oberflächen (N1 und N2) wurden als Testoberflächen verwendet. N1 wurde durch anodische Oxidation auf Reintitan hergestellt, während N2 durch anodische Oxidation auf Titanlegierung (TiAl
6V 4) hergestellt. Auger-Elektronen-Spektroskopie-Analyse der Oxidschicht auf der N1 und N2 Oberflächen offenbart, dass sie größer als 100 nm dick ist und die mittleren Kontaktwinkel für die Steuerung, N1 und N2 Oberflächen zeigten keine signifikanten Unterschiede (51 ° ± 2, 42 ° ± 1 ° , 38 ° ± 0,3 °, respectively) [21]. Profilometrie Messungen der mittleren Rauheit (Sa) zeigte, dass alle Oberflächen mit Sa von 0,18 um für die Steuerfläche eine glatte Topographie hatte, und 0,17 & mgr; m und 0,21 & mgr; m jeweils für die N1 und N2 Flächen [21]. Vor Gebrauch Titan Scheiben wurden für 2 × 10 Minuten mit dem Ultraschallbehandlung in 70% PRO-analys Ethanol gereinigt, gefolgt von Waschen mit sterilem Reinstwasser für weitere 2 x 10 Minuten.
Rasterelektronenmikroskopie
Die Oberflächenmorphologie der Titanscheiben wurden unter Verwendung eines Zeiss ultra-55 Rasterelektronenmikroskop untersucht. Bilder wurden mit einem Sekundärelektronendetektor bei 8000-facher Vergrößerung unter Verwendung einer 10 kV Beschleunigungsspannung und eine Objektivlinse Apertur von 30 & mgr; m gemacht.
Menschliche gingivale Fibroblasten
menschliche gingivale Fibroblasten-Kulturen aus gingival Biopsien von zwei gesunden Probanden erhalten wurden etabliert (im Alter von 11 bis 13 Jahre) ohne klinische Anzeichen von Parodontitis. Die schwedische Zentrale Ethik Review Board genehmigt Stockholm die Sammlung von Biopsien und die Einrichtung der Fibroblasten-Zelllinien (Registernummer 377/98). Gehacktem Stücke Gingiva wurden zu 25 cm explantierten 2 Gewebekulturflaschen (Falcon) mit 5 ml DMEM mit Penicillin (50 Einheiten /ml), Streptomycin (50 ug /ml) und 5% fötalem Kälberserum (FCS ) (Invitrogen Life Technologies, Schottland, UK). unter Verwendung von 0,025% Trypsin in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend 0,02% EDTA bei 90% Konfluenz gingivale Fibroblasten durch Trypsinierung der primären Zell Auswuchs erhalten wurden bei 37 ° C mit 5% CO 2 und routinemßig agiert gezüchtet. Menschliche Gingivafibroblasten zwischen dem 9. und 14. Passagen wurden in dieser Studie verwendet.
Menschliche orale Keratinozyten normalen menschlichen oralen Keratinozyten Immortalized
(OKF6 /TERT-2) [22], erhalten von Dr. James Rheinwald (Brigham und Frauenklinik, Boston, USA), wurden in einem serumfreien Keratinozyten-Medium (Gibco), ergänzt mit 0,2 ng ml -1 humanem rekombinantem epidermalem Wachstumsfaktor, 25 ug Rinder-Hypophysen-Extrakt in Kulturschalen ausgesät ml -1 und 0,3 mM CaCl 2, die 1 IU Penicillin ml -1 und 1 & mgr; g Streptomycin ml -1 (DF-K-Medium) kultiviert und in 5% CO 2 in Luft bei 37 ° C. Das Medium wurde nach dem 1. Tag gewechselt und alle 2-3 aufeinander folgenden Tagen, bis die Zellen erreicht 30-50% Konfluenz. Zellen wurden passagiert, unter Verwendung von 0,05% Trypsin-EDTA (Gibco).
Zelladhäsionsassay
Titanium Scheiben in 24-Well-Gewebekulturschalen (Becton Dickinson) mit entweder Keratinocyten oder Fibroblasten beimpft gingival platziert wurden (1 × 10 < sup> 5 Zellen in 1 ml DF-K-Medium oder DMEM, supplementiert mit Penicillin (50 Einheiten /ml), Streptomycin (50 ug /ml) und 5% fötalem Kälberserum, respectively) und in 5% CO inkubiert 2 in Luft bei 37 ° C für 24 Stunden. Dieser Zeitpunkt wurde gewählt, da eine ausreichende Anzahl von Zellen, um eingehalten hatte die Ergebnisse zuverlässig, aber wenig Zellteilung stattgefunden zu haben. Die Scheiben wurden vorsichtig mit PBS gewaschen, um nicht-anhaftenden Zellen zu entfernen, und gefärbt mit Live /Dead Bac
Licht Färbekit (Molecular Probes). Anhaftende Zellen wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht. Zu bewerten, wie gut die Zellen auf dem Substrat angebracht wurde eine standardisierte Waschprozedur verwendet lose anhaftenden Zellen zu entfernen [23]. Discs in Kulturschalen 1 ml PBS enthielten, wurden für 2 × 5 Minuten (; Co., Deutschland IKA Vibrax Rotationsschüttler, GMBH & amp) bei 100 Umdrehungen pro Minute geschüttelt. Die Zellen nach diesem Verfahren verblieben, wurden nach dem Färben mit Live /Dead Bac
Licht Färbekit und Bildaufnahme mit der Fluoreszenzmikroskopie manuell gezählt. Die Anzahl der Zellen nach dem Waschen verblieb, wurde als Verhältnis der Kontrolle (Anzahl der Zellen, die vor dem Waschen) ausgedrückt.
Bakterienstämme
klinische Isolate von S. gordonii
(HC7), S. mitis
(BA7), S. oralis
(89C) und S. sanguinis
(FC2) wurden in dieser Studie verwendet. S. gordonii
, S. mitis
und S. sanguinis
von approximalen Zahnbelag erhalten wurden, während S. oralis
von einem periimplantären Infektion isoliert wurde. S. gordonii
wurde durch positive phänotypische Tests für N
Acetyl-glukosaminidase identifiziert, N
-acetylgalactosaminidase, α-fucosidase und β-Galactosidase während Identifizierung von S. mitis
beruhte auf positive phänotypische Tests für N
acetyl-Galactosaminidase, N
acetyl- glukosaminidase, β-Galactosidase und Sialidase.
Identifizierung von S. sanguinis
auf phänotypische Tests negativ für Sialidase, arbinosidase, L- beruhte fucosidase, α-Glucosidase und Festhalten an MSA-Agar und S. oralis
auf positive phänotypische Tests auf der Basis identifiziert wurde, für N
-acetylglucosaminidase und Sialidase und einen negativen Test für D-fucosidase, zusätzlich zur Sequenzierung des GDH
und DDL
Gene [24]. Die Bakterien wurden in einer Atmosphäre von 5% CO 2 in Luft bei 37 ° C auf Blutagar gezüchtet. Kolonien wurden auf Bacto Todd-Hewitt-Brühe (TH) (Becton Dickinson & amp; Co) überführt und über Nacht in 5% CO 2 in Luft bei 37 ° C gezüchtet. Die Suspensionen wurden an die frische TH Brühe überführt und bei 37 ° C bis zur Mitte des exponentiellen Wachstumsphase inkubiert wurde erreicht (A 600 ≈ 0,5), entsprechend 10 7 Zellen /ml. Log-Phase-Kulturen von jedem Stamm dann gemischt waren (1: 1: 1: 1) ein Vier-Spezies-Konsortium zu geben und zentrifugiert (4000 g
) für 10 min. Die Pellets wurden dann resuspendiert in serumfreien Keratinozyten-Medium (Gibco), ergänzt mit 0,2 ng ml -1 humanem rekombinantem epidermalem Wachstumsfaktor, 25 ug bovines Hypophysenextrakt ml -1 und 0,3 mM CaCl 2 eine endgültige Konzentration von 10 7 Zellen /ml zu ergeben.
Wirkung der oralen Bakterien auf Keratinozyten Einhaltung
um die Wirkung von oralen Bakterien auf Keratinozyten-Adhäsion, Titanscheiben wurden ausgesät mit 1 ml OKF6 studieren /tert. 2-Zellen und wurden diese erlaubt 16 Stunden zu befestigen. Nach dieser Zeit wurden 1 ml der Vier-Spezies Bakterienkonsortium, das 10 7-Zellen in einem serumfreien Keratinozyten-Medium, wie oben beschrieben, wurde zugegeben, und die Scheiben dann in 5% CO inkubiert 2 in Luft bei 37 & deg; C für weitere 8 Stunden. Nach insgesamt Inkubationszeit von 24 Stunden wurden die Scheiben vorsichtig mit Serum-freien Keratinozytenmedium gewaschen, um nicht-haftenden Zellen und die verbleibenden anhaftenden Zellen mit Live /Dead Bac
Kit Leichte Flecken gefärbt zu entfernen (Molecular Probes) vor der Visualisierung in einem Fluoreszenzmikroskop. Zur Stärke der Anheftung der Bakterien behandelten Zellen an das Substrat zu bewerten, das gleiche standardisierte Waschprozedur wie oben verwendet wurde, beschrieben. Alternativ Titanscheiben wurden mit 1 ml des Vierspezies Bakterien Konsortium beimpft 10 7-Zellen in einem serumfreien Keratinozyten-Medium (5% CO 2 in Luft bei 37 ° C) für 2 Stunden gewaschen und drei enthält, mal mit Serum-freien Keratinozytenmedium vor der Zugabe von 1 x 10 5 Zellen in 1 ml Serum-freien Keratinozytenmedium für 22 Stunden. Bilder Bildanalyse und Statistik
die Experimente wurden dreimal mit unabhängigen Zelle durchgeführt und Bakterienkulturen. Für alle Experimente wurden die Bilder in den gleichen standardisierten zwanzig Punkte auf den Oberflächen genommen, die Mitte und die äußeren Ränder der Scheiben vermieden wird. Die Ergebnisse für die Testflächen wurden im Vergleich zu steuern ANOVA mit Bonferroni Post-Test und p-Werte unter 0,05 signifikant betrachtet.
Ergebnisse
Oberflächenmorphologie
Die Oberfläche REM-Aufnahmen der CpTi Kontrolle und anodisch oxidierten Oberflächen, sind in Abbildung 1 die Oberfläche der CpTi Steuerscheibe hatte eine anisotrope Topographie ähnlich der bearbeiteten kommerziellen Implantate gezeigt. Sowohl die anodisch oxidierte Oberflächen (N1 und N2) hatten Poren in der 50 nm-Bereich. Auf der N1 Oberfläche war die Porendichte hoch und wurden die Poren gleichmäßig über die Oberfläche verteilt, während auf der N2 Oberflächen, die Poren dünn verteilt und gruppierte, was zu größeren porenfreie Bereiche. Abbildung 1 REM-Aufnahmen von CpTi und anodisierte Oberflächen. Repräsentative Bilder der Kontrolle (CpTi) (C), und anodisch oxidierte Oberflächen (N1 und N2). Der Maßstab für 1 & mgr; m.
Befestigung des menschlichen Gingivafibroblasten auf nanostrukturierte Titanoberflächen
Einhaltung der menschlichen Gingivafibroblasten zu den drei Oberflächen, CpTi Kontrolle, N1 und N2 wurde untersucht. Die Zellen wurden 24 Stunden lang anhaften gelassen, bevor sie mit Bac Flecken
Licht Live /Dead und Visualisierung in einem Fluoreszenzmikroskop. Bildanalyse ergab die Zellen eine längliche Morphologie charakteristisch für Fibroblasten zu haben (Abbildung 2a). Auf der CpTi Steuerfläche betrug die Zelldichte relativ hoch (2a), entsprechend etwa 781 ± 87 Zellen mm -2 (Abbildung 2b). Ebenen der Abdeckung für die N2 Oberfläche waren (669 ± 26 Zellen mm -2), auf 85% der Kontrolle entspricht, während Abdeckung auf der N1 Oberfläche (328 ± 84 Zellen mm -2) entsprach 42% der Kontrolle (2a, b). Die Reduktion auf der N1 Oberfläche war signifikant auf dem Niveau von 5% im Vergleich zur Kontrolle. Somit zeigten die gingivale Fibroblasten eine etwas niedrigere Fähigkeit zur N1 zu haften als an die Steuer- und N2 Oberflächen. Abbildung 2 Adherence menschlicher gingivaler Fibroblasten CpTi Kontrolle (C) und die Nanostruktur (N1 und N2) Oberflächen. (A) Verklebt Zellen wurden mit Live /Dead Bac
Licht gefärbt und in einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Der Maßstab entspricht 50 & mgr; m. (B) Graphen, die mittlere Zahl der adhärierten Zellen ± SEM von drei unabhängigen Experimenten. Daten wurden analysiert unter Verwendung von ANOVA mit Bonferroni post-Test (* p & lt; 0,05).
Ein Assay, basierend auf der Anzahl der durch eine standardisierte Waschprozedur entfernt Zellen wurde verwendet, um die Haftfestigkeit der Fibroblasten auf die zu bestimmen drei Oberflächen. Die Anzahl der anhaftenden Zellen nach der Behandlung zurückblieb, wurde als Prozentsatz der anfänglichen Zellzahl auf der gleichen Oberfläche quantifiziert und berechnet. Dies zeigte, dass auf der CpTi Steuerfläche, 33 ± 0,7% der Zellen nach dem Waschen verblieben, während für die N1 und N2 Oberflächen, die entsprechenden Werte waren 44 ± 6,8% und 23 ± 2,7% betragen. Diese Daten zeigen, dass es keinen Unterschied zwischen der Stärke der Haftung der gingivalen Fibroblasten zur CpTi-Steuerung und die nanostrukturierten Oberflächen.
Adherence oraler keratinocyes zu Titanoberflächen, Die andere Weichgewebezellen von Bedeutung für Integration von Zahnimplantaten sind orale Keratinozyten und damit die Adhärenz dieser Zellen zu den drei Oberflächen wurde auch getestet. Nach 24 Stunden wurden die Keratinozyten lebensfähig und wurden als Cluster von Zellen mit einer typischen polygonale Morphologie, gleichmäßig verteilt über die Oberfläche der Titanscheiben (3a) gefunden. Auf der CpTi Steuerfläche betrug die mittlere Anzahl von Zellen 470 ± 73 mm -2. Die mittlere Anzahl der Zellen auf der Oberfläche N1 (419 ± 107 mm -2) war ähnlich dem auf der CpTi während diejenige auf der N2 Oberfläche niedriger war etwas (284 ± 27 mm -2). Diese Werte entsprechen 89% und 60%, bzw. von der Ebene auf der Bedienoberfläche. Keiner dieser Unterschiede war signifikant auf dem 5% -Niveau (Abbildung 3b). Die Haftfestigkeit der Keratinocyten auf der Oberfläche wurde mit der Waschtest untersucht. Ähnliche Verhältnisse der anhaftenden Zellen blieben an allen drei Flächen nach dem Waschen, was darauf hindeutet, dass die Haftfestigkeit der Keratinozyten nicht durch die Anwesenheit von Nanostrukturen (linke Spalte, Tabelle 1) beeinflusst wurde. Abbildung 3 Adherence der menschlichen Mund Keratinozyten CpTi Kontrolle (C) und die Nanostruktur (N1 und N2) Oberflächen. (A) Verklebt Zellen wurden mit Live /Dead Bac
Licht gefärbt und in einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Der Maßstab entspricht 50 & mgr; m. (B) Diagramme von drei unabhängigen Experimenten mittlere Zahl der adhärierten Zellen ± SEM zeigt
Tabelle 1 Keratinozyten auf CpTi (C) und nanostrukturierte Oberflächen (N1 & amp; N2). Nach einem standardisierten Wasch, ausgedrückt als Prozentsatz des Vorwäsche Stufen für die Keratinozyten
gleiche Oberfläche auf Oberflächen nach dem waschen verbleibenden
Oberflächen
- Bakterien
+ Bakterien
C
83 ± 5,5%
96 ± 0,3%
N1
75 ± 1,4%
83 ± 3,5%
N2
94 ± 1,5%
87 ± 4,6%
Einfluss von oralen Streptokokken auf die Bindung von Keratinozyten
In dem Bereich, in dem das Widerlager durch die orale Epithel austritt, an der Anschlagfläche Keratinozyten Befestigung an der Mund microbiota ausgesetzt. Daher ist der Einfluss eines Konsortiums von frühen Kolonisatoren auf Keratinozyten Einhaltung untersucht. Die Anwesenheit von Bakterien während der letzten 8 Stunden der Haftzeit verursacht eine deutliche Verringerung der Anzahl von Keratinocyten auf allen Oberflächen im Vergleich zu dem Niveau in der Abwesenheit von Bakterien (Figur 3b) ersichtlich gefunden, obwohl dieser Unterschied auf die nicht signifikant war 5% -Niveau (4a, b). Eine kleine Anzahl von Bakterien wurden als Cluster gefunden mit zugehörigem sowohl der Titanoberfläche und den anhaftenden Keratinozyten. Diese Daten legen nahe, so dass das Vorhandensein von Bakterien entweder die Fähigkeit der Keratinozyten, reduziert auf die Oberflächen oder verursachte Ablösen der anhaftenden Zellen zu binden. Interessanterweise zeigte der Kern der mit den Bakterien ausgesetzt Keratinozyten 8 Stunden rot oder orange Färbung mit dem Bac
Licht Live /Dead Fleck, der nicht in den unbelichteten Keratinozyten (Abbildung 5) zu sehen war. Dies zeigt, dass die Zellen Propidiumiodid eingetreten war und ist ein Hinweis auf eine Beschädigung der Zellmembran. Die Anwesenheit der Bakterien somit nicht nur erschien eine Verringerung der Nettoanzahl von Zellen zu dem Substrat nach 24 Stunden anhaften, um zu bewirken, sondern auch die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigt. Um die Wirkung von Bakterien auf die Haftfestigkeit von Keratinozyten zu untersuchen, wurde die Wasch Assay auch zuvor zu den Bakterien ausgesetzt Zellen angewendet. Nach dieser Behandlung ist, die keine signifikante Abnahme in der Zahl der Zellen auf der Oberfläche auf die Vorwäsche Niveaus verglichen wurde für jede der Oberflächen (rechte Spalte, Tabelle 1). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, also die Bakterien nicht die Stärke der Haftung der Keratinozyten zu den verschiedenen Oberflächen nicht beeinträchtigte. Die Einhaltung von Keratinozyten auf Oberflächen bereits durch das Konsortium von oralen Streptokokken besiedelt wurde ebenfalls untersucht. Nach 2 Stunden wird vom Konsortium Oberflächenbedeckung war etwa 50% und 20 Stunden nach der Zugabe wurden nur sporadischen Anhaften von Keratinozyten gesehen (Daten nicht gezeigt). So ist die Anwesenheit von frühen kolonisieren Bakterien auf den Titanoberflächen deutlich nachträglichen Anbau von Keratinozyten gehemmt. Abbildung 4 Die Einhaltung der menschlichen oralen Keratinozyten CpTi Kontrolle (C) und nanostrukturierte (N1 und N2) Oberflächen mit einem Konsortium von oralen Streptokokken inkubiert. (A) Verklebt Zellen wurden mit Live /Dead Bac
Licht gefärbt und in einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Der Maßstab entspricht 50 & mgr; m. (B) Graphen mittlere Anzahl von anhaftenden Zellen ± SEM von drei unabhängigen Experimenten zeigt.
5 Wirkungen eines Konsortiums von oralen Streptokokken auf Keratinozyten Abbildung. Menschliche orale Keratinozyten wurden auf Steuerflächen (C) in Abwesenheit (links) oder in Gegenwart (rechts) von einem Konsortium von oralen Streptokokken gewachsen. Der Maßstab entspricht 50 & mgr; m.
Diskussion
Zuvor viel Arbeit auf die Modifikation von TiO 2 Oberflächen fokussiert hat haben sowohl Osteoblasten Adhärenz in vitro
sucht Osseointegration und Studien zu verbessern [13, 14] und Gewebeintegration in vivo
[25]. Es gibt jedoch immer noch erhebliche Lücken in unserem Wissen über die Einhaltung und Funktion von Weichgewebezellen an der Abutment-Mukosa-Schnittstelle. In dieser Studie wurde das Anhaften von Keratinozyten und Fibroblasten auf zwei Oberflächen; eine durch anodische Oxidation auf CpTi (N1) und der andere durch anodische Oxidation auf einer Titanlegierung (N2), wurde auf einer Steuer CpTi Oberfläche derjenigen ausgebildet, verglichen. Sowohl die modifizierten Oberflächen wurden nanostrukturierte mit Poren in den 50 nm-Bereich die gesamte Oberfläche bedeckt. Allerdings unterschieden sie sich in Porendichte, mit spärlicher verteilten Poren und mit größeren porenfreien Bereichen auf der N2 als auf der N1 Oberfläche. Sowie nanoskalige Modifikationen können anodische Oxidation Veränderungen in der Schüttgutoberfläche verursachen, und das TiO 2 Oberflächenschichten von N1 und N2 nachgewiesen wurden zu höheren Ebenen der kristallinen Anatas als die CpTi Steuerung [21] enthalten. Obwohl zytotoxische Wirkungen auf Bakterien in Gegenwart von UV-Strahlung [26] festgestellt worden ist, wird wenig auf eukaryotische Zellen über die Wirkung von oberflächenassoziierten Anatas bekannt. In dieser Studie wurde jedoch gezeigt, der Anatas-reichen N1 und N2 Oberflächen keine zytotoxische Wirkung entweder auf Fibroblasten oder Keratinozyten.
Die Muster der menschlichen gingivalen Fibroblasten binden war etwas anders als der Keratinozyten. Beide Fibroblasten und Keratinozyten konnten die CpTi Kontrolle und die nanostrukturierte Oberflächen zu binden. dass am wurde jedoch, während das Niveau der Anhaftung von Fibroblasten auf die Oberflächen N2 ähnlich war signifikant reduziert CpTi Steuerung, die Einhaltung der N1 Oberfläche. Für Keratinozyten, obwohl die Anzahl der Zellen etwas niedriger auf der N2 war, gab es keine signifikanten Unterschiede in der Gesamtzelldichte auf den nanostrukturierten Oberflächen im Vergleich zu dem auf CpTi Kontrolle. Die Daten zeigen somit, dass das Vorhandensein und die Verteilung der Poren auf der Einhaltung der oralen Keratinozyten während für Gingivafibroblasten keinen Einfluss hatte, eine hohe Porendichte Einhaltung reduziert. Dies legt nahe, dass die Bindung von gingivale Fibroblasten durch die Art des Substrats beeinflußt wurde, daß während der Keratinozyten nicht in dem gleichen Ausmaß beeinflußt. In einer Studie von Ma et al
., Das Vorhandensein von Nanoröhrchen mit einem Durchmesser von etwa 100 nm Fibroblasten Einhaltung reduziert im Vergleich zu einer polierten Titan Kontrolle [27], während Guida et al
. zeigte oxidierte nanostrukturierte Oberflächen im Vergleich zu Kontrollen erhöht gedreht Titan Fibroblast Adhärenz [19]. Schlussfolgerungen in Bezug auf die Auswirkungen von Nanostrukturen auf Fibroblasten-Funktion sind somit nur schwer aus der aktuellen Literatur zu ziehen. Für Keratinozyten Daten ist begrenzt, aber Zile et al
. [18] haben gezeigt, dass Nanorohroberflächen fördern Einhaltung Titan gezeigt im Vergleich zu herkömmlichen Nano glatten Oberflächen. In dieser Studie war die Anzahl von Keratinocyten zu den herkömmlichen Titanoberfläche anhaftende vergleichbar zu der für die Steuerflächen in ihrer Studie beobachtet, obwohl keine Zunahme der Zelldichte auf den nanostrukturierten Oberflächen hier verwendet wurde beobachtet.
Die Bildung von eine dichte Abdichtung zwischen dem Implantat und den umgebenden Weichgewebe wird erwartet, dass zur Erhaltung der gesunden Gewebe um ein Implantat [28, 29] beizutragen. Studien an Hunden durchgeführt wurden, ergaben, dass Sol-Gel-abgeleiteten nanoporösem Titanoberflächen, die Entwicklung von hemidesmosomalen Wechselwirkungen zwischen der Mundschleimhaut induzieren kann und der Implantatoberfläche [16]. Ebenso in menschlichen Subjekten, den Kontakt zwischen der Mundschleimhaut und Titanimplantaten wurde in Gegenwart von Sol-Gel abgeleiteten Titanoxidfilme [17] erhöht. Deshalb ist die Haftfestigkeit der Keratinozyten und Fibroblasten wurde unter Verwendung eines Verfahrens untersucht, die schwach anhaftenden Zellen entfernt. Ein ähnliches Verfahren wurde zuvor untersucht, die das Anhaften von Epithelzellen und Fibroblasten zu Titan [23] verwendet. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten keine Unterschiede in der Haftfestigkeit von Keratinozyten oder Fibroblasten zu den anodisch oxidierten Oberflächen im Vergleich zu CpTi Kontrolle darauf hinweist, dass die Nanostrukturen nicht die Stärke der Befestigung der beiden Zelltyp nicht beeinflusste.
Dieser Genehmigen mit den Ergebnissen aus einem anderen in vitro
Studie, in der Haftfestigkeit von Fibroblasten nicht durch Oberflächenbedingungen und Materialien [30] betroffen war. Jedoch Fibroblasten in einem größeren Ausmaß von allen Oberflächen als die Keratinozyten entfernt wurden, für diese Zellen eine niedrigere Gesamthaftfestigkeit anzeigt. Die meisten in vitro
Studien des Einflusses von Implantatoberflächeneigenschaften auf Wirtszellhaftung
gewesen in bakterienfreien Umgebungen vorgenommen. Jedoch, wenn eine Anschlagfläche in der Mundhöhle platziert wird, die Kapazität der Weichgewebezellen, insbesondere Keratinozyten, kann zu haften durch die Anwesenheit von Mikroorganismen in der Mundumgebung beeinflusst. Die Wirkung eines Konsortiums von frühen Kolonisations Streptokokken auf Haftung und Haftfestigkeit von Keratinozyten wurde daher untersucht. Keratinozyten Anhaften war weitgehend verhindert wird, wenn Bakterien wurden bereits auf den Titanoberflächen darauf hindeutet, dass Weichgewebeheilung stark durch die Anwesenheit von mikrobiellen Biofilms auf der Anlagefläche beeinflußt werden. Exposition von Keratinocyten auf die gleichen Bakterien, verringerte Zelldichte von etwa 50% und die Integrität der Zellmembran der verbleibenden Zellen Befestigungs erschienen kompromittiert werden. Während die hier beobachteten Zellschäden etwas überraschend, da die orale Streptokokken war normalerweise nicht pathogen, werden in Betracht gezogen wurden ähnliche Ergebnisse in In-vitro-Studien
erhalten, wo Osteoblasten auf die Haut commensal ausgesetzt waren, Staphylococcus epidermidis
[31, 32] . Es ist bekannt, dass commensal streptococci eine Reihe von metabolischen Endprodukte einschließlich Lactat, Acetat, Ethanol produzieren und sowie Enzyme (Glycosidasen und Proteasen) und bakterielle Antigene einschließlich Lipoteichonsäure (LTA) formiat, die als mögliche Mechanismen für die beobachtete betrachtet werden kann Zellschädigung [33, 34]. Während Keratinozyten LTA durch Toll-like-Rezeptoren reagieren können [35] werden die Wirkungen anderer Substanzen auf Keratinozyten-Funktion wird derzeit nicht gut verstanden. Alle Autoren haben gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.
