Zusammenfassung
Hintergrund
das weiche Gewebe um Zahnimplantate bildet eine Barriere zwischen der oralen Umgebung und dem periimplantären Knochen und einem entscheidenden Faktor für den langfristigen Erfolg der Therapie ist die Entwicklung eines guten Widerlager /Weichteildichtung. Sol-Gel abgeleiteten nanoporösen TiO
2 Beschichtungen Weichgewebebefestigung, aber ihre Wirkung auf die Adhäsion und Biofilmbildung durch orale Bakterien zu verbessern gezeigt wurde, ist nicht bekannt.
Methoden kaufen Wir untersuchten, wie die Eigenschaften von Oberflächen, kann auf Aufbauten verwendet werden: gedreht Titan, Sol-Gel-nanoporösen TiO 2 beschichteten Oberflächen und anodisierte Ca 2 + modifizierten Oberflächen, beeinflussen die Bildung von Biofilmen durch zwei frühe Kolonisatoren der Mundhöhle: Streptococcus sanguinis
und Actinomyces naeslundii
. Die Bakterien wurden unter Verwendung von 16S rRNA-Fluoreszenz in situ Hybridisierung
zusammen mit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie nachgewiesen.
Ergebnisse | Interferometrie und Rasterkraftmikroskopie zeigte, alle Oberflächen glatt sein (S a ≤ 0,22 & mgr; m) . Die Inkubation mit einem Konsortium von S. sanguinis
und A. naeslundii
zeigten keine Unterschiede in der Haftung zwischen den Oberflächen über 2 Stunden. Nach 14 Stunden war das Niveau der Biofilmwachstum niedrig und wieder wurden keine Unterschiede zwischen den Oberflächen gesehen. Die Anwesenheit von Speichel des Biofilms Biovolumen von S. sanguinis
erhöht und A. naeslundii
das Zehnfache im Vergleich zu, wenn Speichel abwesend war und dies war aufgrund der erhöhten Haftung statt Biofilmwachstum.
Schlussfolgerungen
nano-topographischen Änderung der glatten Titanoberflächen hatte keine Wirkung auf die Adhäsion oder frühe Biofilmbildung durch S. sanguinis
und A. naeslundii
im Vergleich zu gedrehten Oberflächen oder solche mit anodischer Oxidation in Gegenwart von Ca behandelt 2+. Die Anwesenheit von Speichel führte zu einem signifikant größeren Biofilm Biovolumen jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen den Testflächen gesehen. Diese Daten deuten darauf hin, so dass die Modifikation mit Sol-Gel abgeleiteten nanoporösen TiO 2, die gezeigt hat, die Osseointegration und Weichgewebeheilung in vivo
zu verbessern, verursacht keine größeren Biofilmbildung durch die beiden oralen commensal Spezies getestet als . die anderen Flächen elektronische ergänzendes Material
die Online-Version dieses Artikels
(doi:. 10 1186 /1472-6831-11-8) enthält zusätzliches Material, das autorisierten Benutzern zur Verfügung
. Hintergrund
Zahnimplantate aus Titan sind häufig zu ersetzen verlorene Zähne und viel Arbeit wurde konzentriert sich auf die Optimierung der physikalisch-chemischen und mechanischen Eigenschaften von Implantatmaterialien verwendet, um ihre Integration mit Host-Knochen und Weichgewebe zu verbessern. Das Weichgewebe Barriere um Zahnimplantate dient als Schutzdichtung zwischen der oralen Umgebung und die zugrunde liegenden periimplantären Knochen und ein Faktor vorgeschlagen von Bedeutung Therapie für die langfristigen Therapieerfolg des Implantats zu sein, ist die Entwicklung eines guten Widerlager /weich -tissue Dichtung [1]. Verschiedene Oberflächenmodifikationen von Implantaten, einschließlich Mikro topographischen und chemischen Oberflächenveränderungen, haben für ihre Auswirkungen auf die Heilung des Gewebes und vor kurzem untersucht worden, Interesse hat Änderungen im Nanometer- Auflösungsebene gedreht [2]. Nanofeatured Oberflächen werden als solche mit Strukturen kleiner als 100 nm in mindestens einer Dimension betrachtet und nanofeatures haben mindestens vier kommerziell erhältlichen Implantaten charakterisiert [3]. Sol-Gel-abgeleiteten nanoporösem TiO 2 -Beschichtungen gezeigt wurden Weichgewebebefestigung in Ratten- und Hundemodellen [4-6] und einer experimentellen Studie in menschlichen zu verbessern zeigten, dass ein deutlich größerer Anteil der Mundschleimhaut in Kontakt mit a war nanoporösen TiO 2 Oberfläche als mit einer nicht modifizierten Oberflächen [7].
Oberflächen in der Mundhöhle sind schnell mit einem Häutchen von Proteinen und Glykoproteinen aus Speichel und Sulkusflüssigkeit sowie sezerniert mikrobielle Produkte [8] abgeleitet bedeckt . Die Zusammensetzung sowie die Konfiguration und die Dichte der Proteine in dem Pellicle, ist weitgehend abhängig von der physikalischen und chemischen Beschaffenheit der darunterliegenden Oberfläche und damit die Eigenschaften der Oberfläche beeinflussen bakterielle Adhäsion, obwohl die Häutchen. Zahlreiche Mikroorganismen in der planktonischen Phase an die Oberfläche transportiert werden, aber es ist, die Eigenschaften des Konditionierungs Film mit Hafteigenschaften von Bakterien, die bestimmen, welche Organismen befestigen und Biofilmbildung einzuleiten. Biofilmbildung auf der Zahnoberfläche wird durch Adhäsion der frühen Kolonisatoren wie S. sanguinis
und A. naeslundii initiiert
[9]. Die anfänglichen Kolonisatoren fördern die Adhäsion von Sekundär Kolonisatoren durch Co-Aggregation und mikrobielle Wechselwirkungen führen zu Reifung des Biofilms [10]. Die microbiota gesunder Implantaten wird angenommen, daß auf der Zahnoberfläche [11, 12] und Streptococcus spp
gesehen ähnlich. und Actinomyces naeslundii
wurden bereits Kolonisatoren auf eine Reihe von Implantatmaterialoberflächen in vivo
[13] identifiziert. Wie ist der Fall für Zahnbelag ist, sind die Kapazitäten für das Wachstum und den Stoffwechsel die ökologischen Determinanten des Überlebens und Persistenz von oralen Bakterien auf Implantatoberflächen. Vermehrung und den Stoffwechsel der Mikroorganismen führt letztlich zu der Entwicklung einer strukturell organisierten mikrobiellen Gemeinschaft anhaftenden, die in einem Gleichgewichtszustand mit dem Host ist [14]. Oral Krankheit kann auftreten, wenn lokale Umweltfaktoren in der Biofilm die Selektion und Anreicherung von vermeintlichen Krankheitserreger Fahrt zum resident Mikrobiota gehören, damit eine Entzündungsreaktion induzieren progressive Knochenresorption bei Zahnimplantaten [15].
Aufgerauhte Titanabutment Oberflächen initiiert wurde gezeigt, zu erhöhen, die Bildung von Plaque in vivo
[16]. Jedoch im Vergleich, glatte Auflageflächen mit Oberflächenrauigkeitswerte von & lt; 0,3 μ m fördern Biofilmbildung in vivo
im gleichen Maße [17] nicht. Glatte Oberfläche, gedreht (TU) Titan, nanoporösen TiO 2 beschichtet (SG) und eloxierten Ca 2+ modifiziert (OC) Oberflächen haben alle für die Osseointegration sowie Weichgewebeheilung geeignet sein [7 gezeigt, 18, 19]. In dieser Studie zeigen wir, dass es in der frühen Bildung von Biofilmen keine signifikanten Unterschiede sind durch S. sanguinis
und A. naeslundii
, auf diese drei glatten Oberflächen. Jedoch führte die Anwesenheit von Speichel Entwicklung eines wesentlich größeren Biofilm Biovolumen durch diese beiden Kolonisatoren auf allen Oberflächen, als wenn Speichel nicht vorhanden war.
Methoden
Herstellung von Titanoberflächen
Kommerziell reines Titan gedreht Scheiben (Grad 4), mit einem Durchmesser von 8 mm und einem zentralen Loch, wurden in vier Gruppen eingeteilt. Die ursprünglichen gedreht Scheiben dienten als Kontrollen (TU) und die anderen Gruppen wurden jeweils modifiziert in einer von drei verschiedenen Arten: Sol-Gel-Behandlung eines nanoporösen TiO 2 coat (SG) zu schaffen, wärmebehandelt in einer ähnlichen Weise zu die Sol-Gel behandelten Scheiben (HT) oder anodisierte und Kalzium (OC) behandelt
für die Sol-Gel-Behandlung (SG), Scheiben wurden in einer basischen Wasserstoffperoxidlösung (H 2 O gereinigt;. 30 % H 2 O 2 und 25% NH 4 OH im Verhältnis 5: 1: 1) bei 85 ° C für fünf Minuten. Nach ausgiebigem Spülen in destilliertem Wasser, wurden Scheiben in strömendem N 2 getrocknet. Das Sol wurde durch Mischen von Lösung 1 hergestellt [10,22 g tetraisopropylorthotitanate, (Merck, Hohenbrunn, Deutschland) in 15 ml Ethanol gelöst] mit Lösung 2 [15 ml Ethanol, 170 & mgr; l H 2 O und 840 & mgr; l HNO 3 ]. Nach einstündigem Mischen wurden 100 ul PEG 400 (Merck, Hohenbrunn, Deutschland) zugegeben und die Lösung kräftig gerührt. Das klare Sol wurde bei Raumtemperatur während der Alterung und dem Tauchbeschichtungsprozesses gehalten. Tauchbeschichtung wurde unter Verwendung eines computergesteuerten Schrittmotor Stufe mit einer Eintauchgeschwindigkeit von 30 mm /min durchgeführt und die Scheiben wurden in einem Ofen bei 500 ° C (Luft) 30 min lang gesintert. Nach dem Erhitzen wurden die Scheiben in Ethanol für vier Minuten und schließlich getrocknet in strömendem N 2 mit Ultraschall gereinigt. Die wärmebehandelten Oberflächen (HT), die als Kontrollen für den SG Oberflächen bedient wurden bei 500 ° C (Luft) gesintert, wie oben beschrieben. Die anodisierte und Calcium eingebaut (OC) Oberflächen wurden durch anodische Oxidation hergestellt mit einem Elektrolyten, bestehend aus Natriumglycerophosphat Hydrat (C 3 H 6 (OH) 2PO 4Na 2 × H 2 O) und Calciumacetat (Ca (CH 3COO) 2) [20, 21].
Charakterisierung von Titanoberflächen
zum Oberflächenrauhigkeit auf der Mikrometer-Ebene zu untersuchen, drei Scheiben jede Oberfläche wurden an zehn Standorten unter Verwendung eines optischen Interferometers (MicroXamTM, Phaseshift, Tucson, USA) untersucht. Jede Messung wurde über eine 200 × 260 & mgr; m-Bereich durchgeführt. Ein Hochpass Gaussian Filter (50 × 50 & mgr; m) wurden zu getrennten Rauhigkeit von Fehlern der Form und Welligkeiten [22] verwendet. Die Auswertung erfolgte mit der Surfascan Software durchgeführt und die Bilder wurden mit SPIP ™ (Scanning Probe-Bildprozessor, Bild Metrology, Dänemark) hergestellt. Drei verschiedene dreidimensionale Parameter wurden verwendet, um die Oberfläche zu charakterisieren: mittlere Höhenabweichung [S a (um)], ein räumlicher Parameter - Dichte von Gipfeln [S ds (1 /& mgr; m 2)] und ein Hybrid-Parameter einschließlich Variation in der Höhe und Raumrichtung [S dr (%)].
die Topographie des Modells Silikaoberflächen, tauchbeschichtet, wie für die SG Oberflächen, wurde unter Verwendung von Rasterkraftmikroskopie (AFM 3100 gekennzeichnet , Nanoscope III, Digital Instruments). Um die Topographie im Nanoauflösungsniveau, das zweidimensionale Oberflächenparameter, durchschnittliche Höhenabweichung [R a (nm)] zu charakterisieren, wurde angewendet. Die Dicke der SG-Beschichtung wurde mit null Ellipsometrie bei λ = 632 nm (Auto-El-III, Rudolph Forschung, USA) gemessen. Die angenommene Brechungsindex von TiO 2 in Anatas-Kristallstruktur war n = 2.49.
Bakterienstämme und Kultur
Für Biofilm Assays, die die orale Typ-Stamm Streptococcus sanguinis
ATCC 10556 und Actinomyces naeslundii
isoliert von Zahnbelag [23] verwendet wurden. Alle Stämme wurden auf Blut-Agar oder in Todd-Hewitt-Brühe (TH) bei 37 ° C in 5% CO routinemßig gehalten 2.
Assay für die Adhäsion und Biofilmbildung frühen
Unmittelbar vor bakterieller Inokulation Scheiben in einem Ultraschallbad mit Extran MA01 gereinigt wurden ® (Merck, Darmstadt, Deutschland) verdünnt 01.40 in destilliertem Wasser, mit Ethanol behandelt, und in Polystyrol mit 6 Vertiefungen (Flachboden) Titerplatten (Multi-Well ™ platziert, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Über Nacht Brühekulturen wurden 01.50 in frisch verdünnt, Brühe vorgewärmten Todd Hewitt bei 37 ° C in 5% CO 2 und aufgewachsen in die Mitte der exponentiellen Wachstumsphase (OD 600 nm≈0.6). Kulturen wurden dann Endkonzentrationen von etwa 1 × 10 8 Zellen /ml für S. sanguinis Karten und 1 × 10 7 Zellen /ml für A. naeslundii
geben verdünnt. 1,5 ml von S. sanguinis
und 4,5 ml der Suspensionen
A. naeslundii wurden dann in die Vertiefungen inokuliert. Die Mikrotiterplatte wurde mit Paraffin Klebeband verschlossen und bei 37 ° C auf einem Rotationsschüttler bei 300 Umdrehungen pro Minute in 5% CO 2 inkubiert. Nach der Inkubation für 2 und 14 h wurden die Oberflächen dreimal mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer gespült, pH 7,5 (PBS) locker gebundene Zellen zu entfernen. Die anhaftenden Bakterien wurden in 4% Paraformaldehyd für 16S-rRNA Hybridisierung fixiert. Alle Biofilm Experimente wurden unter Verwendung unabhängiger Bakterienkulturen dreimal für jeden Oberflächentyp durchgeführt.
Für die Speichel Experimenten unstimulierten ganze Speichel wurde von einem gesunden Freiwilligen mit guten Mundgesundheit gesammelt, für 10 Minuten zentrifugiert, Muzine und Bakterien zu pelletieren, und der Überstand sterilfiltriert (Porengröße 0,22 um). Aliquots der Bakteriensuspensionen (1,5 ml von S. sanguinis
und 4,5 ml A. naeslundii
) wurden zentrifugiert und das Pellet wurde in 6 ml des sterilen Speichel resuspendiert. Bakteriensuspensionen (enthaltend 10 7 koloniebildende-Einheiten pro ml, wie durch Kultivierung gezeigt) wurden dann zu den Vertiefungen. Die Platten wurden in einer Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C vorsichtig für 14 Stunden geschüttelt. Nach dieser Zeit Oberflächen wurden dreimal mit 3 ml PBS, mit 4% Paraformaldehyd gespült und über Nacht bei 4 ° C inkubiert.
16S rRNA FISH und konfokaler Laserscanning-Mikroskopie
fixierten Bakterien auf den Platten mit kaltem gewaschen , sterile PBS und mit 100 ul Lysozym (Sigma, St. Louis, MO, USA) [zu Zellmembranpermeabilisierung unterworfen (70 U & mgr; l -1) in 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 (Sigma, St. Louis, MO , USA), 5 mM EDTA (Merck, Damstadt, Deutschland)], für 9 Minuten bei 37 ° C enthält. Nach dem Spülen mit ultrareinem Wasser wurden die Bakterien durch eine Reihe von Ethanolwaschschritten entwässert. Hybridisierungspuffer [0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, mit 0,01% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 25% Formamid], enthaltend 20 ng markierter Oligonucleotidsonde ml -1 pipettiert auf die Titanscheiben . Die Sonde Cocktail bestand aus der Streptokokken-Sonde STR493 (5'-GTTAGCCGTCCCTTTCTGG-3 ') [24], fluoreszierend mit ATTO-488 grün markiert, um die Menge von S. sanguinis
und eine rot-markierten ATTO-565 Sonde zu bewerten EUB338 (5'-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3 ') [25] Gesamt Biofilm Volumen zu beurteilen. Hybridisierung wurde für 90 Minuten in einer feuchten Kammer bei 47 ° C durchgeführt. Die Oberflächen wurden dreimal mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), enthaltend 5 mM EDTA und 0,01% Natriumdodecylsulfat gewaschen und zweimal mit 159 mM NaCl, 30 und 15 Minuten, bei 47 ° C unter leichtem Schütteln inkubiert. Schließlich wurden die Titanoberflächen mit eiskaltem Reinstwasser gewaschen, montiert und auf Glasobjektträger für die Analyse geklebt mit invertierten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) (Eclipse-TE2000, Nikon Corporation, Tokio, Japan). Grüne Fluoreszenz wurde durch einen Ar-Laser (488 nm Laseranregung) zur Verfügung gestellt und die rote Fluoreszenz von einem G-He-Ne-Laser (543 nm Laseranregung) gegeben wurde. CLSM-Bilder wurden mit einem -Ölimmersionsobjektiv erworben (× 60). Jeder Stapel hatte ein Substrat Abdeckung Feldbereich von 215 × 215 & mgr; m, und die z-Schritt betrug 2 um. Die Bilder wurden von 15 zufällig ausgewählten Stellen pro Scheibe. Bilder Bildanalyse erhalten
Die Bildstapel in TIFF-Format konvertiert wurden und analysiert, um die bioImage_L Software [26] die Strukturparameter des Biofilms zu berechnen. S. sanguinis
nimmt die universelle Sonde EUB338 sowohl nach oben (rot) (Abbildung 1a) und die Streptokokken spezifische STR493 Sonde (grün) (Abbildung 1b) und in den Bildern präsentiert diese Zellen aufgrund Co-Lokalisation der Sonden gelb erscheinen (Abbildung 1c). A. naeslundii
, die nur die EUB338 Sonde einnimmt, erscheint rot (Abbildung 1c). Da die Software verwendet wird, könnte gelben Zellen nicht identifizieren, die Biovolumen von S. sanguinis
wurde mit den Zahlen von grünen Zellen quantifiziert. Der Biofilm Biovolumen von A. naeslundii
wurde dann indirekt berechnet, indem der S. sanguinis
(grün) Biofilm Biovolumen vom Gesamt subtrahiert wird. Figur 1 16S rRNA Fluoreszenz in situ Hybridisierung Bilder von S. sanguinis und A. naeslundii in mono- und Dual-Spezies Biofilmen. CSLM Bilder zeigt Dual-Spezies Biofilme von S. sanguinis
und A. naeslundii
gefärbt (a) mit dem roten EUB338 16S-rRNA-FISH-Sonde, (b), gefärbt mit dem grünen STR493 16S-rRNA-FISH-Sonde oder (c) mit den beiden Sonden gefärbt. Der Balken zeigt 4 um statistische Analyse
Die nicht-parametrischen Mann-Whitney-U-Test zwischen den Test- und Kontrollflächen und p-Werte & lt analysieren Unterschiede in der Biofilm Biovolumen verwendet wurde. 0,05 wurden als signifikant angesehen. Ergebnisse und Diskussion
Charakterisierung der Titanoberflächen
Charakterisierung der Oberflächenorientierung durch Interferometrie ergab, dass das nanoporöse (SG) Oberfläche als auch die wärmebehandelt (HT) und anodische Ca oxidierte 2 + eingebaut (OC) Oberflächen waren isotrop, während die gedrehte Oberfläche (TU) war anisotropen (mit orientierten Oberflächentopographie) (Abbildung 2, linke Spalte). Die Messungen der Oberflächenparameter (Abbildung 2, rechte Spalte), ergab, dass die nanoporöse (SG) Oberfläche eine mittlere Oberflächenhöhenabweichung hatte (S a) von 0,16 ± 0,04 um, während die entwickelte Oberfläche [27] und Gipfel Dichte ( S ds) waren 3 ± 1% und 0,13 ± 0,005 Gipfel /& mgr; m 2 jeweils. Diese Topographie war ähnlich dem des wärmebehandelten Kontrolle (HT) (S a 0,16 ± 0,02 & mgr; m, S dr 3 ± 1%, S ds 0,12 ± 0,007 Gipfel /& mgr; m 2) und der eingeschaltet (TU) (S a 0,18 ± 0,02 & mgr; m, S dr 4 ± 1%, S ds 0,13 ± 0,022 Gipfel /& mgr; m 2) Oberflächen. Die anodische Oxidation Ca 2 + eingebaut (OC) Oberfläche hatten jedoch höhere Werte für mittlere Höhenabweichung (0,22 ± 0,01 & mgr; m), Flächenverhältnis entwickelt Fläche (15 ± 2%), und Gipfel Dichte (0,23 ± 0,003 Gipfel /um 2). Somit hatte die OC Oberfläche etwas größer mikrotopographischen Strukturen als die anderen Oberflächen untersucht und hatte eine größere potentielle Fläche für bakterielle Wechselwirkungen. Doch trotz der Unterschiede auf der Mikroebene der Rauheit zwischen der TU, SG und HT auf der einen Seite und der OC Oberfläche auf der anderen Seite waren alle so glatt kategorisiert (dh
S a. & Lt; 0,5 μ m) [28]. Figur 2 Interferometry Bildern und Oberflächeneigenschaften der glatten Titanoberflächen. Bilder von Interferometrie wurden mit SPIP ™ hergestellt. Die durchschnittliche Höhenabweichung (Sa), Dichte von Gipfeln (SDS) und Oberflächenvergrößerung (Sdr) für die verschiedenen Oberflächen gezeigt; SG (Sol-Gel abgeleiteten nanoporösen TiO2 beschichtet), HT (wärmebehandelt), TU (gedreht) und OC (anodisch Ca2 + oxidiert eingebaut) Oberflächen.
TiO Rasterkraftmikroskopie Oberflächenabbildung von Sol-Gel abgeleiteten nanoporösen 2 Flächen zeigte, daß die Teilchen gut verteilt und organisiert (Abbildung 3). Die Beschichtung führte zur Bildung von Nanostrukturen von wenigen Nanometern bis zu 100 nm mit R eine 1,58 nm. Die Dicke der nanoporösen TiO 2 -Beschichtung, betrug 90 nm ± 10 nm, wie durch Ellipsometrie gemessen. Abbildung 3: Charakterisierung der nanoporösen TiO 2 beschichteten Oberfläche unter Verwendung von Rasterkraftmikroskopie. Eine repräsentative AFM-Bild der nanoporösen TiO 2 beschichteten Oberfläche. Beachten Sie die homogen und gleichmäßig verteilt nanofeatures.
Eigenschaften von glatten Oberflächen haben keinen Einfluss auf die Haftung und frühen Biofilmbildung von S. sanguinis und A. naeslundii Das Hauptziel der vorliegenden Studie
war mikrobielle Adhäsion an nanoporösen TiO zu untersuchen < sub> 2 (SG) Oberflächen und vergleichen Sie diese mit anderen glatten Titanoberflächen für Implantat-Abutments verwendet. Das verwendete Modell ist kompatibel mit CLSM da die Scheiben in dem Mikroskop direkt auf Glas-Dias und betrachtet montiert werden. Die Menge der Bakterien auf den Oberflächen nach 2-stündiger Inkubation wurde als das Niveau der Anhaftung von Bakterien an der Oberfläche zu repräsentieren. Nach 2 Stunden, A. naeslundii
und S. sanguinis
waren auf allen Oberflächen wie dünn verteilte Zellcluster (Abbildung 3b - oberes Feld). Der Biofilm Biovolumen auf der Oberfläche SG war ähnlich dem auf der HT-Steuerung und der TU Oberfläche. Die OC Oberfläche zeigte jedoch einen etwas höheren Grad der Haftung, aber dies war nicht-signifikant verschieden von der auf den anderen Oberflächen (p = 0,05) (Figur 4a). So scheint es, dass die höhere Ebene der mikroskaligen Rauheit für die OC-Oberfläche gesehen nicht ausreichend war, um die Bakterien aus der Entfernung Kräften zu schützen. Ähnliche Ergebnisse in einem in-vivo
Studie erhalten wurden, in denen mit einem S a Flächen = 0,21 & mgr; m zeigte etwas größere Mengen an Mikroorganismen als solche mit S a im Bereich von 0,05 bis 0,13 & mgr; m [29] haften und eine durchschnittliche Rauheit in der Höhe (R a) von 0,2 um wurde als Schwelle für eine signifikante bakterielle Adhäsion vorgeschlagen [17]. Der Anteil an A. naeslundii
war größer als die von S. sanguinis
auf allen Oberflächen (etwa 85% des Biofilms Biovolumen) darauf hindeutet, daß unter diesen Bedingungen, A. naeslundii
war besser in der Lage zu haften als S. sanguinis
. Abbildung 4 Biofilmbildung von S. sanguinis und A. naeslundii über 2- und 14-Stunden auf den glatten Titanoberflächen. (A) Graphen, die die Mittelwerte ± SD von Biofilm Volumen von drei unabhängigen Sätzen von Experimenten erzeugt zeigt. SG (Sol-Gel abgeleiteten nanoporösen TiO2 beschichtet), HT (wärmebehandelt), TU (gedreht) und OC (anodisierte und Ca2 + enthalten sind). Keine signifikanten Unterschiede wurden zwischen den Oberflächen zu jedem Zeitpunkt zu sehen. (B) Repräsentative Bilder von CSLM von 2- und 14-Stunden-Biofilme visualisiert mit 16S rRNA FISH unter Verwendung von Oligonukleotid-Sonden Targeting S. sanguinis
(STR493 - grün) und alle Bakterien (EUB338 - rot). Da sowohl die rote EUB338 und die Sonde grün STR493 wurden von S. sanguinis
aufgenommen, erscheinen die Zellen gelb während A. naeslundii
, die nur die EUB338 Sonde enthält erscheint rot. Die Skalierungsbalken stellen 10 & mgr; m.
Nach 14 Stunden in Gegenwart von TH Wachstumsmedium wurden die anhaftenden Bakterien begann sich zu teilen und zu wachsen und die Ebenen der mikrobiellen Abdeckung sind also die Anfangsphasen der Biofilmbildung zu reflektieren, betrachtet. Allerdings waren die Mengen an Wachstums hier gesehen zwischen zwei und 14 Stunden niedrig und dies die Tatsache widerspiegeln, dass bei Kontakt mit einer Oberfläche, Planktonbakterien einen Übergang von exponentiellem Wachstum auf eine viel langsamere Wachstumsrate [30] zu unterziehen. Keine Unterschiede in der Höhe der Deckung zwischen den verschiedenen Oberflächen auf (4b, unteres Bild) beobachtet werden. In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen wurden keine Unterschiede in der Gesamt Biofilm Biovolumen zwischen den vier Oberflächen festgestellt. Der relative Anteil an S. sanguinis
war auf 31% erhöht, obwohl die Pegel als der A. die noch niedriger waren naeslundii
(69%). Obwohl also die Ausgangswerte der Haftung auf der Oberfläche OC etwas höher waren, möglicherweise aufgrund der größeren Oberfläche wurde diese nicht aufrechterhalten, wie der Biofilm zu entwickeln begann.
Saliva Adhäsion von S. sanguinis und A. naeslundii verstärkt in Zwei-Spezies Biofilmen
um zu untersuchen, wenn Speichel betroffen Oberflächenhaftung, S. sanguinis
und A. naeslundii
in sterilen Speichel vor der Belichtung auf die Oberflächen aufgehängt wurden. Dies erhöht die Haftung beider Spezies auf allen Oberflächen nach 2 Stunden (5b, oberes Feld). Die Bakterien waren als Cluster, wahrscheinlich aufgrund der Aggregation von mit Speichelproteinen bedeckt Zellen. Der Anstieg bis zu 11-fach (5a), wie in Abwesenheit von Speichel (4a) gegenüber darauf hindeutet, dass Speichel die Adhäsion dieser beiden Spezies gefördert. Im Gegensatz dazu wurde in früheren Studien Vorbeschichtung von Titanoberflächen mit experimentellen Speichel Häutchen nicht gezeigt das Anhaften von A. naeslundii zu beeinflussen
[31]. Dieser Unterschied kann auf die Tatsache zurückzuführen, dass bei der Untersuchung von Lima et al
. 2008 wurden Bakterien in Nährlösung suspendiert, anstatt Speichel. Figur 5 Biofilm-Bildung durch S. sanguinis und A. naeslundii in Gegenwart von Speichel über 2- und 14-Stunden auf den glatten Titanoberflächen. (A) Graphen, die die Mittelwerte ± SD von Biofilm Volumen von drei unabhängigen Sätzen von Experimenten erzeugt zeigt. SG (Sol-Gel abgeleiteten nanoporösen TiO2 beschichtet), HT (wärmebehandelt), TU (gedreht) und OC (anodisierte und Ca2 + enthalten sind). Keine signifikanten Unterschiede wurden zwischen den Oberflächen zu jedem Zeitpunkt zu sehen. (B) Repräsentative Bilder von CSLM von zwei- und 14-Stunden-Biofilme visualisiert mit 16S rRNA FISH unter Verwendung von Oligonukleotid-Sonden Targeting Streptococcus sanguinis
(STR493 - grün) und alle Bakterien (EUB338 - rot). Da sowohl die rote EUB338 und die Sonde grün STR493 wurden von S. sanguinis
aufgenommen, erscheinen die Zellen gelb während A. naeslundii
, die nur die EUB338 Sonde enthält erscheint rot. Die Skalierungsbalken stellen 25 & mgr; m.
Nach 14 Stunden keine wesentliche Veränderung in dem Biofilm Biovolumen gesehen wurde, was anzeigt, daß kein Wachstum in Gegenwart von Speichel aufgetreten war. Allerdings sind diese Daten wahrscheinlich Biofilmbildung und das Wachstum in vivo
da in Biofilmen auf Implantatoberflächen Rekrutierung von einer Reihe anderer Bakterienarten zu unterschätzen erlauben würde, eine konzertierte Aktion Speichel Glykoproteine abzubauen und damit Nährstoffe für das Wachstum zur Verfügung stellen [32] . Die unterschiedlichen Oberflächen zeigten keine Unterschiede in Gesamt Biofilm Biovolumen (p & lt; 0,05). Und der Anteil der Bakterienspezies war ähnlich an beiden 2 und 14 Stunden, wobei A. naeslundii
etwa 80% der Biovolumen bildet
das verwendete Modell hier aktiviert die verschiedenen Oberflächen in Gegenwart von Speichel zu testen. Die Verwendung von 16S rRNA FISH ermöglicht die Detektion von Interspeziesvariationen in Adhäsion und Wachstum sowie die räumlichen Beziehungen zwischen Bakterien auf verschiedenen Oberflächen. Darüber hinaus sorgt das umfangreiche Spülung während des 16S-rRNA-FISH-Verfahren, dass nur wirklich anhaftenden Bakterien auf der Oberfläche während der Quantifizierung vorliegen. Ein Nachteil des Modells ist, dass die sanft verwendet Schütteln hier nicht genau die Scherkräfte, die an einer Oberfläche in der Mundhöhle ausgesetzt gelegt werden muss. Dies könnte jedoch durch die Verwendung eines Strömungskammer-Modell [33] gelöst werden. Schlussfolgerungen
Nano-topographischen Änderung der glatten Titanoberflächen verursachen nicht wesentlich größere Haftung und Biofilmbildung von S. sanguinis
und A. naeslundii in vitro
als auf gedrehten Oberflächen oder solche, behandelt mit Ca gefunden wurde 2 + Einbau während die anodische Oxidation. In Gegenwart von Speichel, wurde die Haftung mehr als das Zehnfache im Vergleich erhöht in Abwesenheit von Speichel und keine Unterschiede waren zwischen den Oberflächen gesehen. Diese Daten legen nahe, dass die Modifikation mit Sol-Gel-abgeleiteten nanoporösem TiO 2, die Weichgewebeheilung gezeigt worden ist, in vivo
zu verbessern, führt nicht zu einer größeren Haftung und Anfangsbiofilmbildung durch die zwei Arten getestet commensal als die anderen Oberflächen. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass über einen längeren Zeitraum in Gegenwart von anderen Bakterienspezies, größere Unterschiede in der Biofilmbildung auf den verschiedenen Oberflächen gesehen werden kann
Liste der Abkürzungen
CLSM.
konfokalen Laser-Scanning-micrscopy
PBS:
10 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,5
FISH:
Fluoreszenz in situ
Hybridisierung
TU:
Oberflächen gedreht
OC:
anodisierte Ca 2 + eingebaut Oberflächen
SG:
Sol-Gel abgeleiteten nanoporösen TiO 2 beschichteten Oberflächen
HT:
wärmebehandelten Oberflächen.
Erklärungen
Danksagung
Diese Studie wurde von der schwedischen Dental Society, der Hjalmar Svensson Research Foundation, der schwedischen Research Council (AW) und die Knowledge Foundation, Schweden unterstützt wurde.
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die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Beiträge der Autoren
VF bei der Planung der Studie teilnahmen, führte den größten teil der Arbeit im Labor, und beteiligte sich an der Datenanalyse und Erstellung des Manuskripts. PL bereit, die Sol-Gel abgeleiteten Oberflächen und bei der Abfassung des Manuskripts beteiligt. AW nahmen an der Studie der Planung und der Erstellung des Manuskripts. LCP beteiligte sich an der experimentellen Design und Erstellung des Manuskripts. GS nahmen an Studiendesign, Datenanalyse und Erstellung des Manuskripts. JRD nahmen an der Datenanalyse und Erstellung des Manuskripts. Alle Autoren haben gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.
