Zusammenfassung
Hintergrund
Präklinische Studien unterstützen die Annahme, dass Bindegewebstransplantate Alveolarknochen aus Resorption zu bewahren; die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen bleiben jedoch unbekannt. Die zellulären Mechanismen können zur parakrine Aktivität der palatinalen Fibroblasten zurückzuführen. Es war daher sinnvoll, dass palatal Bindegewebstransplantate die Bildung von Osteoklasten reduzieren vorzuschlagen.
Methods
diese Hypothese zu testen, wurden humane Fibroblasten palatal sucht auf ihre Fähigkeit, die Bildung von Osteoclasten in murine Knochenmarkskulturen zu modulieren ausgesetzt RANKL, M-CSF und TGF-β1. Osteoclastogenesis wurde von Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) Färbung und Genexpressionsanalyse bestimmt. Die Bildung von Antigen-präsentierenden Zellen wurde basierend auf der Expression von CD14 und costimmulatory Moleküle von Antigen-präsentierenden Zellen. Die parakrine Interaktion von Fibroblasten und das Knochenmark wurde mit Inserts von zell okklusiven Membranen in vitro modelliert.
Ergebnisse
Cokulturen ohne Zell-zu-Zell-Kontakt, palatinalen Fibroblasten eine Abnahme der Expression des Markers Osteoklasten verursacht Gene in Knochenmarkzellen; Calcitonin-Rezeptoren, Cathepsin K, TRAP und Osteoklasten-assoziierten Rezeptors. Auch die Anzahl der TRAP positive kernige Zellen wurde in Gegenwart von Fibroblasten vermindert. Bemerkenswert ist, erhöht Gaumen Fibroblasten die Expression von CD14 und die kostimulatorischen Proteine CD40, CD80 und CD86 in Zellen des Knochenmarks. Knochenmarkzellen hatte keine erheblichen Auswirkungen auf die Fibroblasten-Lebensfähigkeit und Proliferation Markergene. Im Hinblick auf die Zellverteilung waren Osteoklasten prominentesten in der Mitte der Membranen, während unmittelbar akkumulierten Fibroblasten zur Grenze des Einsatzes benachbart zu einer ringartigen Struktur auf der Oberfläche der Kulturplatte bildet.
Schlussfolgerung Die
Daten legen nahe, dass palatal Fibroblasten eine parakrine Umgebung bereitzustellen, die Osteoklastogenese und erhöht Marker von Antigen-präsentierenden Zellen reduziert. Morover, eine gemeinsame Aktivität zwischen Gaumen- Fibroblasten und Knochenmarkzellen die parakrine Modell durch die charakteristische Zellverteilung in den beiden getrennten Kammern.
Schlüsselwörter Palatinale Fibroblasten Osteoklasten Makrophagen Co-Kultureinsätze Murine Knochenmarkkulturen Hintergrund sichtbar enthüllt
Palatinale Bindegewebstransplantate für Wurzeldeckung in der Parodontologie verwendet werden und Gingivarezession Defekte [1] zu behandeln. Palatal Bindegewebstransplantate haben auch ästhetische Parameter zu verbessern, wenn bukkalen Knochen dünn oder resorbiert in der Implantologie und Prothetik [2-6] vorgeschlagen. Je nach der verwendeten Technik, palatal Bindegewebstransplantate kann in direktem Kontakt mit Alveolarknochen plaziert werden. Die Frage stellt sich über die möglichen Auswirkungen der Palatinalflächen Bindegewebstransplantate auf dem Kieferknochen. Es gibt zumindest schwache Unterstützung für eine mögliche Rolle des Bindegewebes Transplantate in den darunter liegenden Knochen zu erhalten. Bindegewebstransplantat bei bukkal der knöchernen Wand platziert, unmittelbar nach der Zahnextraktion, ergab eine angemessene Erhaltung der harten Gewebe [7]. Darüber hinaus können gingivale Bindegewebstransplantate die Resorption der Randleiste in Hunde-Modelle [8] zu reduzieren. Zusammengenommen unterstützen beide präklinischen Studien die Annahme, dass Bindegewebstransplantate den Alveolarknochen bewahren kann; aber die zugrunde liegenden zellulären Mechanismus ist unbekannt.
Die zellulären Mechanismus kann auf die parakrine Aktivität der Gaumen Fibroblasten zurückgeführt werden. Diese Annahme wird durch in vitro-Experimente mit isolierten Gingiva Fibroblasten und ihre Fähigkeit zur Beeinflussung von Osteoclasten, die Bildung von Knochen-resorbierenden Zellen unterstützt. Beispielsweise konditionierte Medium aus Fibroblasten und Gingiva Desmodonts Fibroblasten erhalten hemmen, die Bildung von Osteoclasten-ähnliche Zellen in Maus-Knochenmarkskulturen [9-11]. Es ist daher wahrscheinlich, dass parakrine Faktoren aus Gaumen- Fibroblasten freigesetzt wird, kann den Prozess der osteoclastogenesis reduzieren. Weitere interessante ist, den molekularen Mechanismus, wie die parakrine Faktoren freigesetzt von Gaumen Fibroblasten zu verstehen, die Expression von Genen darstellen Osteoklasten zu ändern, sondern auch Zellen das Antigen-präsentierenden, Fom hämatopoetischen Vorläuferzellen beide stammen.
Osteoclastogenesis in murine Kulturen Knochenmark erfordert die Präsenzen von Rezeptor-Aktivator von nuclear factor kappa-B-Ligand (RANKL), M-CSF, und die entsprechenden Rezeptoren [12]. Osteoklasten sind typischerweise mehrkernige und Express Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP), Cathepsin K (catk) und dem Calcitonin-Rezeptor (CTR). Osteoklasten auch co-stimulatorische Moleküle Aktivierung des Immunorezeptor Tyrosin-basiertes Aktivierungsmotiv (ITAM) -abhängigen Weg [13] exprimieren. Osteoklasten-assoziierten Rezeptors (OSCAR) und das Auslösen Rezeptor in myeloischen Zellen exprimiert (TREM2) sind Rezeptoren, die mit den entsprechenden Adaptermoleküle Fc-Rezeptor gemeinsame gamma-Kette (FcRγ) und DNAX-aktivierendes Protein 12 kDa (DAP12) zugeordnet sind, jeweils [13] . Wenn die Differenzierung zu einem Makrophagen-Phänotyp verschiebt, die Expression von CD14, ein Co-Rezeptor für Lipopolysaccharid Signalisierung und den kostimulatorischen Proteine CD40, CD80 und CD86, exprimiert üblicherweise in Antigen-präsentierende Zellen, wie Monozyten und Makrophagen, steigen [14, 15].
Ziel dieser vorliegenden Pilotstudie war es, die Auswirkungen der parakrine Umgebung von Gaumen Fibroblasten auf osteoclastogenesis aus dem Knochenmark-Vorläufer zu untersuchen, ein in vitro-Modell, wo beide Zellquellen getrennt werden durch zellokklusiv Membranen.
Methoden
Fibroblasten Menschliche Gaumen
Menschliche Gaumen Fibroblasten aus Explantatkulturen von drei unabhängigen Spender nach der Genehmigung des Ethikkommission der Medizinischen Universität Wien (EK Nr. 631/2007) hergestellt. Fibroblasten, die aus den Explantaten wuchsen aus und war nicht mehr als fünf Passagen wurden verwendet, unterzogen. Fibroblasten wurden in Dubeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kultiviert mit Antibiotika (Invitrogen Corporation Carlsbad, CA, USA)) und plattiert auf 100.000 Zellen /cm
2 in den jeweiligen Platten mit 12 Vertiefungen (Greiner-Bio-One GmbH) . Nach der Anbauperiode, Färbung der Fibroblasten wurde mit DiffQuik (Roche Diagnostic Systems, Basel, Schweiz) durchgeführt.
Murine Knochenknochenmarkzellen
Markkulturen durch Spülen Femur und Tibia von 4 bis 8 Wochen alte weibliche vorbereitet wurden Balb /c-Mäuse (BE76 /12 Veterinärdienst des Kantons Bern) und entkernt in ThinCert ™ Zellkultur-Einsätze (12-Well-Format mit einer Nennporengrößen von 0,4 & mgr; m; Greiner-Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland) bei einer Million Zellen pro cm 2 in Eagle-Minimum Essential Medium-Alpha Modification (& agr; MEM) bei 25 & mgr; g /ml mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), Antibiotika, M-CSF ergänzt, TGF-β1 bei 10 ug /ml und RANKL bei 25 & mgr; g /ml. Knochenmark-Kulturen wurden dann auf die Platten übertragen, die die Fibroblasten enthielt. Rekombinante Proteine wurden aus Prospec (Ness-Ziona, Israel) erworben. Knochenmarkszellen wurden mit und ohne die Fibroblasten kultiviert. Beide Zelltypen bleiben die zellokklusiv Membran der ThinCert ™ Zellkultur-Einsätze getrennt. Die Färbung für TRAP (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) wurde am Tag fünf durchgeführt. Die Zellen wurden Osteoklasten als wenn sie positiv für TRAP und mit drei oder mehr Kerne wie durch Lichtmikroskopie beobachtet.
Expression von Markergenen in murinen Knochenmarkkulturen
RNA aus den Knochenmarkskulturen und den Gaumen Fibroblasten isoliert wurde mit der Hoch Reine RNA Isolation Kit (Roche Applied Science, Rotkreuz, Schweiz). Die reverse Transkription (RT) wurde mit Transcriptor Universal-cDNA-Master durchgeführt und PCR wurden in dreifacher Ausführung unter Verwendung von TaqMan-Universal-PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) oder den Fast Start Universal-Sonde Master-Rox auf einem 7500 Real-Time PCR-System durchgeführt Analysen ( Roche). Knochenmarkzellen wurden für die folgenden Gene analysiert: SybrGreen: RANK, C-FMS, TRAF6, C-FOS, MITF, PU1, NFATc-1, DC-STAMP, ATP6V0D2, CD14, CD40, CD80, CD86, CD11c; TaqMan (Applied Biosystems, Carlsbad, CA): CTR, CATK, TRAP, OSCAR, TREM2, DAP12, FCRγ. BCL2, PLK1, CCNB1, CCNE1, CCND1, MYBL2, GAPDH, BAD, BAX und BCL-XL: Fibroblasten wurden für die folgenden Gene analysiert. Die Daten wurden normalisiert für β-Aktin mit dem ΔΔCt Methode (Tabellen 1 und 2) .Tabelle 1 SybrGreen Primer für die RT-PCR
Gene
Vorwärtsprimer
Reverse-Primer
m 18 s
tccagcacattttgcgagta
cagtgatggcgaaggctatt
m βactin
ctaaggccaaccgtgaaaag
accagaggcatacagggaca
m RANK
gtgctgctcgttccactg
agatgctcataatgcctctcct
m c-fms
gaccatggtgaatggtaggg
ggataacgttgaatcccactg
m TRAF6
ttgcacattcagtgtttttgg
tgcaagtgtcgtgccaag
m c-fos
gcaactttctatgacactgaaacac
tctctctagggctgcattgg
m MITF
gacaccagccataaacgtca
ttttccaggtgggtctgc
m PU1
ggagaagctgatggcttgg
caggcgaatctttttcttgc
m NFATc-1
ccgttgcttccagaaaataaca
tgtgggatgtgaactcggaa
m DC-Stamp
aagctccttgagaaacgatca
caggactggaaaccagaaatg
m Atp6vOd2
aagcctttgtttgacgctgt
gccagcacattcatctgtacc
m CD14
aaagaaactgaagcctttctcg
agcaacaagccaagcacac
m CD40
gagtcagactaatgtcatctgtggtt
accccgaaaatggtgatg
m CD80
tcgtctttcacaagtgtcttcag
ttgccagtagattcggtcttc
m CD86
gaagccgaatcagcctagc
cagcgttactatcccgctct
m CD11c
gagccagaacttcccaactg
tcaggaacacgatgtcttgg
h βactin
ccaaccgcgagaagatga
ccagaggcgtacagggatag
h BCL2
caggagaatggataaggcaaa
ccagccagatttaggttcaaa
h PLK1
aaccgagttattcatcgagacc
ttggttgccagtccaaaatc
h CCNB1
cctccggtgttctgcttc
ttcagcattaattttcgagttcc
h CCNE1
ggccaaaatcgacaggac
gggtctgcacagactgcat
h CCND1
gccgagaagctgtgcatc
ccacttgagcttgttcacca
h MYBL2
gtcaaatggacccatgagga
gtcagtgcggttagggaagt
h GAPDH
agccacatcgctcagacac
gcccaatacgaccaaatc
h BAD
cgagtttgtggactcctttaaga
caccaggactggaagactcg
h BAX
agcaaactggtgctcaagg
tcttggatccagcccaac
h BCL XL
agccttggatccaggagaa
agcggttgaagcgttcct
Tabelle 2 TaqMan Primer Assay-ID für die RT-PCR
m CTR
Mm 00432282_m1
m catk
Mm 00484039_m1
m TRAP
Mm 00475698_m1
m Oscar
Mm 00558665_m1
m TREM2
Mm 04209424_g1
m DAP12
Mm 00449152_m1
m FcRγ
Mm 02343757_m1
Statistische Analyse
Zellkulturen wurden unter Verwendung von mindestens getan Baum unterschiedlich Fibroblasten-Spender. Die beiden Gruppen wurden mit dem gepaarte T
Test mit α & lt verglichen; 5%.
Ergebnisse
