Zusammenfassung
Hintergrund
Krüppel-like factor 4 (KLF4) ist ein Transkriptionsfaktor Regulierung proliferations Differenzierung Gleichgewicht des Epithels und Down- in weniger differenzierten und erweiterten oralen Karzinome geregelt. Obwohl die Expression durch den Promotor hypermethylation in malignen Tumorzellen inaktiviert, so bleibt es unbekannt, in oralen Karzinomzellen.
Methods
Genomische DNA aus neun verschiedenen Zellkarzinom oral Linien isoliert und eine normale Keratinozyten-Linie wurde mit Natriumbisulfit behandelt, und Methylierung an KLF4
Gen-Promotor wurde durch PCR-Direct-Sequence-Analyse bestimmt. . KLF4 Expression in kultivierten Zellen mit oder ohne Demethylierungsmittel durch quantitative Echtzeit-PCR und Immunoblot wurde überwacht
Ergebnisse
Ein 237-bp-Promotorregion Spanning - 718 und - 482 von KLF4
Gen wurde in der mündlichen hypermethyliert Karzinomzellen, die KLF4 exprimieren
auf einem niedrigen Niveau, aber die Methylierung war selten in Zellen KLF4
hoher Menge exprimiert. Der Downstream-Bereich von - 481 bis 192 wurde in allen Zelllinien nicht methyliert. Demethylierung Behandlung von Zellen die Expression auf mRNA und Protein-Ebene hochreguliert.
Fazit
Diese Studie zeigte, dass Hyper in einem engen Bereich der Promotorregion KLF4 Expression herunterreguliert, und schlägt vor, dass der Verlust der Expression durch die Hyper trägt zur oralen Karzinoms Progression
Schlüsselwörter Gene Promotor hypermethylation Krüppel-like factor Mundkrebs elektronische ergänzendes Material
Die Online-Version dieses Artikels (doi:.. 10 1186 /s12903-016-0172- 5) enthält zusätzliches Material, das autorisierten Benutzern zur Verfügung steht.
Hintergrund
Oral Karzinome sind häufigste bösartige Tumor der Kopf und Hals, aber die Prognose der Patienten wurde nicht ausreichend verbessert. Karzinomzellen bei invasiven Front zeigen häufig anomale Genexpression und entdifferenzieren in mesenchymalen zellähnlichen Zustände in einem Prozess der Krankheitsprogression [1-3]. Darüber hinaus ist nachhaltige Proliferation andere herausragende Merkmal in einer aggressiven Untergruppe von Karzinomen. Die Proliferation und Differenzierung Gleichgewicht der Zellen steuern Entwicklung und Homöostase des Epithels und spielen eine definitive Rolle bei pathologischen Zustand von Karzinomen [4]. Sie sind weitgehend durch Tumor unterdrückende Gen reguliert, und die Expression der Gene wird häufig von epigenetischen Mechanismen inaktiviert [5]. Es ist wichtig, eine Ursache zu inaktivieren tumorsuppressive Genexpression zu verstehen Mechanismen der oralen Karzinomprogression zu enthüllen.
Geschichteten Plattenepithel einschließlich Mundepithel, Krüppel-like factor (KLF) 4 und 5 werden in post-mitotischen keratinisierend Suprabasalzellen ausgedrückt und proliferative weniger differenzierten basalen Zellen. Sie steuern kritisch proliferations Differenzierung Gleichgewicht des Epithels [6, 7]. KLFs transkriptionell regulieren Zielgenexpression auf den Promotor durch die Bindung, und frühere Studien, dass der Verlust von KLF4 Expression assoziiert mit Entdifferenzierung der oralen Karzinomzellen dokumentiert und wird in einer aggressiven Untergruppe der Karzinome häufig beobachtet [7, 8]. Es schlägt eine Beteiligung der Verlust der Expression in Karzinomen Progression.
Da chromosomale Deletion von KLF4
Genlocus bei 9q31.2 ist ein seltenes Ereignis in Karzinomen [9, 10], epigenetische Inaktivierung des Gens ist ein Haupt Kandidat für den Verlust des Ausdrucks. Unter epigenetische Aberrationen in Karzinomzellen gefunden wird, ist Promotor hypermethylation ein häufigste ursächliche Genexpression zu inaktivieren [11, 12]. Tatsächlich hypermethylation in KLF4
Genpromotor und Enhancer ist in Karzinomen des Dickdarms, des Magens, des Gebärmutterhalses und der Niere [13-16] dokumentiert. Jedoch werden die hypermethylated Regionen in Karzinomen unterschiedlicher Herkunft und unbekannten in oralen Karzinome variabel lokalisiert. In dieser Studie untersuchten wir die Hypermethylierung und die Korrelation mit KLF4 Ausdruck in der oralen Karzinomzellen.
Methoden
Zelllinien Oralkarzinom-Zelllinien (Ca9.22, Ho-1-u-1, HOC313, HSC2
, HSC3, KOSC3, OSC19, SCCKN, TSU) und eine immortalisierte aber nicht normale Keratinozyten-Zelllinie transformiert, HaCaT [17], wurden in 10% fötalem Rinderserum enthaltenden Medium.
Bisulfit modifizierte Sequenzanalyse von KLF4
Gen Promoter-Methylierung Staaten bei KLF4
Promotorregion wurden nach einer früheren Studie analysiert [18]. Genomische DNA aus den Zellen isoliert wurden, mit Natriumbisulfit behandelt und für die PCR-Amplifikation der Promotorregion angewendet Spanning - 718 und 192 (die Transkriptionsstartstelle wurde als +1 gesetzt) für Direct-Sequence-Analyse. Die Primer-Sequenzen, die für die Analyse verwendet werden, sind wie folgt: 5 '-
-736GTATGTTAGTAGGGGTG-3' (vorwärts), 5 '- -442GAGTTTGTTGATTTAGTTGT-3' (vorwärts), 5 '- -331AAGGAAGTTATAAGTAAGGAA- 3 '(vorwärts), 5' - -72AATAAAACTAACTACC-3 '(rückwärts), und 5' - + 213AAACCCAAAACCCCAAATTAA-3 '(rückwärts). Wir bezeichnet eine DNA-Sequenzdaten von KLF4
Gens GenBank (DQ658241.1).
Quantitative real-time PCR
Gesamt-RNA isoliert Form Zellen mit oder ohne 5 uM 5-Aza-2-Desoxycytidin ( 5-Aza) Behandlung wurde revers in cDNA transkribiert von MultiScribe Reverse Transkriptase (Applied Biosystems) und Echtzeit-PCR unter Verwendung des StepOne Real-time PCR-System (Applied Biosystems) auf quantitative unterzogen. PCR-Bedingungen waren 95 ° C für 20 s, gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C für 1 s und 60 ° C für 20 s. Die TaqMan-Sonden spezifisch für KLF4
(Hs00358836_m1, Applied Biosystems) verwendet. Expressionsspiegel normalisiert gegen ACTB
(TaqMan endogene Kontrolle Menschliche ACTB, Applied Biosystems) wurden von der Standardkurve Verfahren (2 -ΔΔCt) berechnet. relativ fache Änderungen des Ausdrucks, der Ausdruck nach dem 5-Aza-Behandlung Zur Analyse durch, dass ohne Behandlung geteilt.
Immunoblot
Gesamt-Zelllysate in SDS-Probenpuffer, der 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und Protease-Inhibitor-Cocktail ( Roche Diagnostic GmbH) unter den reduzierenden Bedingungen einer SDS-Polyacrylamid-Gelen aufgetragen und elektrotransferiert auf PVDF-Membranen. Die Membranen wurden mit Antikörpern gegen KLF4 (Santa Cruz Biotechnology) oder β-Actin (Sigma-Aldrich), gefolgt von Meerrettich-Peroxidase-konjugierten sekundären Antikörpern sondiert. Die Signale wurden Chemi-Lumi Ein Super (Nakarai Tesque) und erfasst auf Ez-Capture-MG (ATTO) nachgewiesen werden.
Ergebnisse | Expression von KLF4 in oralen Karzinomzellen
Expression von KLF4
mRNA durch die Echtzeit-PCR (Fig. 1) quantifiziert. Unter Karzinomzelllinien wurde stark in HaCaT normalen Keratinozyten ausgedrückt. Es wurde auf einem relativ hohen Niveau in KOSC2 Zellen und HOC313 Zellen, niedriger in HSC2 Zellen, Ho-1-u-1-Zellen und Ca9.22 Zellen und nicht nachweisbar in OSC19 Zellen nachgewiesen. Feige. 1 Expression von KLF4
mRNA in oralen Karzinomzelllinien und normale Keratinozyten (HaCaT). KLF4
Expression wurde quantitativ durch das Echtzeit-PCR untersucht. Relative Expression wurde durch Expression ACTB
in jeder Probe standardisiert (n
= 4) und im Vergleich mit der Expression in HaCaT-Zellen
Promoter hypermethylation in Karzinomzellen
Methylierung an KLF4
Genpromotor aus - 718-192 wurde durch die Bisulfit-modifizierten PCR-Direct-Sequence-Analyse untersucht. Der Promotor enthalten 109 Methylierung anfälligen Cytosin (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S1), und wir beschrieben Methylierungszustand jedes Cytosin als U (unmethylierten), M (methyliert) oder U /M (Mischung aus unmethylation und Methylierung) in dieser Studie. Im Gegensatz zur Abwesenheit von Methylierung in HaCaT-Zellen, alle Zellinien Karzinom enthielten M und /oder U /M Cytosine und Häufigkeit von M Cytosin war stark unterschiedlich (Fig 2 und den weiteren Datei. 1: Tabelle S1). Die Methylierung wurde in einem 237-bp-Region spanning beschränkt - 718 und - 482, die 39-Methylierungs-empfindlichen Cytosine bezeichnet als # 1 bis # 39 und die Cytosine in 673-bp-Region enthält nachgeordnet 39 # Cytosin (# 40- # 109 ) wurde nicht methyliert. Computeranalyse zeigte, dass das 237-bp-Region enthält Methylierungs-empfindlichen Cytosine an vier Sp1-Bindungsstellen (# 5, 6, 23, 34 und 38 Cytosine) und eine PU.1-Bindungsstelle (# 19 Cytosin). Die # 5, 6, 19 und 23 Cytosine wurden häufig in Zellen methyliert, die KLF4
auf niedrigem Niveau exprimiert (Bild 3 und zusätzliche Datei. 1: Tabelle S1). Feige. 2 Methylierung von KLF4
Gen-Promotor. eine Position der Methylierung anfälligen Cytosine in dem Promotor wird als blau (obere Linie
) angegeben und die Cytosine werden von # 1 bis # 109 numerisch nummeriert. Untere Linien zeigen Cytosine, die vollständig methyliert (schwarz und) oder nicht methylierten (weiß
) und Mischung von Methylierung und unmethylation (grau
). M% und U /M% zeigen Prozentsatz der methylierten Cytosine und die Mischung in 39 Cytosine sind. b Sequenzdaten auf # 10 und # 11 Cytosine. Vier Karzinomzelllinien, die methylierte (M) und unmethylierter (U) Cytosine und die Mischung (U /M) wurden als Beispiel
Fig dargestellt. 3 Der Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen in der 237-bp-Region. Methylierungs-empfindlichen Stellen sind durch rot markiert, und Sp1-Bindungsstellen (blaue Pfeile
) und PU.1-Bindungsstelle (grüne Linie
) angegeben
KLF4
Ausdruck nach dem Demethylierung
Um zu untersuchen, wurde eine Beteiligung der Methylierung in KLF4 Expression wurden die Zellen mit einem Demethylierungsmittel 5-aza und die Expression an mRNA und Proteinmengen analysiert behandelt. Die Behandlung erhöht stark die mRNA-Expression in TSU-Zellen und insbesondere HSC2 Zellen (Fig. 4a), in dem der Promotor wurden ausgiebig hypermethyliert. Andere Zelllinien erhöht die Expression verschieden, ohne OSC19 Zellen, die mRNA unter einem nachweisbaren Niveau exprimiert. KLF4 Proteinexpression war auf die mRNA-Expression fast identisch. Es war nicht nachweisbar in HSC2 Zellen, HSC3 Zellen, Ho-1-u-1-Zellen, TSU-Zellen und OSC19 Zellen. Nach der Demethylierung Behandlung hypermethyliert HSC2 Zellen und TSU-Zellen stark hochreguliert die Proteinexpression (Abb. 4b) und Ho-1-u-1-Zellen, HOC313 Zellen und Ca9.22 Zellen, die kein M Cytosin enthalten hat die nicht erhöhen Ausdruck. OSC19 Zellen exprimierten das Protein nicht wie mRNA. Unter drei Zelllinien sowohl M und U /M Cytosine in verschiedenen Raten enthält, HSC3 Zellen und KOSC2 Zellen erhöht offenbar den Ausdruck aber noch (SCCKN Zellen) nicht. Feige. 4 Expression von KLF4 nach der Demethylierung. a Relative Falte KLF4
mRNA-Expression in mit 5-aza Demethylierungsmittel behandelten Zellen durch die Expression unterteilt ohne 5-aza-Behandlung (n
= 4). b KLF4 Protein-Expression in Zellen, die mit (+) und ohne (-) 5-Aza-Behandlung wurden durch Immunoblot untersucht. β-Actin wurde als interne Kontrolle
Diskussion verwendet
Karzinomzellen aggressives Verhalten in einem Prozess der Progression zu erwerben durch die Aktivierung und Inaktivierung von Tumor-assoziierten Genexpression. KLF4 Ausdruck wird in vielen Arten von Karzinomen im fortgeschrittenen Stadium verringert und der Verlust der Expression initiiert epithelial-mesenchymale Transition von Karzinomzellen, die stark die Progression stimuliert [19]. In der Tat ist KLF4 in weniger differenzierten und erweiterten oralen Karzinome-down-reguliert und unterdrückt Entdifferenzierung der Zellen [7]. Obwohl der Promotor-Hypermethylierung als Ursache für den Verlust der Expression betrachtet wird [13-16], ist es nicht in der oralen Karzinome bekannt. Diese Studie zeigt, dass die Expression eng korreliert mit hypermethylation Zustände bei einer 239 bp-Region im Promotor.
Hypermethylation zur Geninaktivierung verantwortlich ist häufig in CpG Inseln von Tumorunterdrückungsgenen beobachtet [11, 12], und es wurde gezeigt in KLF4
Gen in dieser Studie, was darauf hindeutet, dass die Region ist wichtig KLF4 Expression in oralen Karzinomzellen zu regulieren. Dies wird durch diese Demethylierung Behandlung hochreguliert KLF4 mRNA und Protein in den hypermethylated Zellen, nicht aber die Zellen ohne Hyper unterstützt. Ca9.22 Zellen, Ho-1-u-1-Zellen und OSC19 Zellen, die nicht fast hypermethyliert waren, sahen den Ausdruck nicht erhöhen. Er schlägt vor, ein Vorhandensein von zusätzlichen Faktoren, die den Ausdruck zu aktivieren. Es ist jedoch klar, dass die Hypermethylierung für KLF4 Herunterregulierung zuständig ist, und dass die 237 bp-Region eine wichtige Rolle bei der Expression spielen.
Hypermethylation von KLF4
Gen ist an Enhancer des Gens geschah in humane maligne Tumorzellen; -2.128 -1.770 ~ Region in Medulloblastom Zellen [20] und - 1.852 ~ -1.658 Region in Zervixkarzinom-Zellen [15]. Obwohl wir an der Enhancer in dieser Studie Methylierung an Promotorregion nicht angesprochen hat Methylierung ist direkt als Plattform Genexpression im allgemeinen [11, 12] zu regulieren. (.; Ref 14 -130 ~ -13 Region) und in kolorektalen Karzinomzellen (. ~ +79 +355 Region; ref 13) hypermethylation in KLF4
Genpromotor wurde in Magenkarzinomzellen beobachtet worden, aber die - 481 ~ +192 Region wurde in dieser Studie nicht methyliert. Es zeigt an, dass hypermethylation in einem 237-bp-Region beschränkt von - 718 bis - 482 ist wichtig für die negative Regulation in oralen Karzinomzellen. Jüngste Beweise festgestellt, dass hypermethylation ist designierten bei unterschiedlichen Region Gen für Zell-Linie und Zelltyp-Spezifikation [11, 12] Promotor /Enhancer in verschiedenen Typen von Krebszellen und der Promotor hypermethylation auftritt. Es ist plausibel, dass die Hypermethylierung-empfindlichen Stellen in oralen Karzinomzellen lokalisieren abgesehen von anderen Typen von Karzinomzellen.
Die 237-bp-Region kodiert Sp1 und PU.1-Bindungsstellen, die für die Expression erforderlich sind [21, 22] . Sp1 spielt eine entscheidende Rolle bei der epithelialen Entwicklung [23, 24], und Klf4
- /-
Mäuse orale Karzinome entwickeln [8, 25]. Daher Hypermethylierung im 237-bp-Region erscheint in KLF4 Herunterregulierung eine bedeutende Rolle zu haben. Da Verlust der Expression KLF4 eng mit oralen Karzinomprogression assoziiert, kann der Ausdruck der Wiederherstellung eine faszinierende Strategie sein, um die Patienten zu behandeln.
Schlussfolgerungen
Diese Studie zeigte, dass KLF4
Gen-Promotor in oralen Karzinomzellen hypermethyliert wurde bei einer unterschiedlichen Bereich von anderen Typen von-Karzinomzellen, und dass es mit KLF4 Expression assoziiert war. Da KLF4 tumorsuppressive ist, kann seine Inaktivierung durch den Promotor hypermthylation ein Mechanismus der oralen Karzinoms Progression sein, wie in den Zeilen in dieser Studie analysierten Zellkarzinom
Abkürzungen
5-Aza.
5-Aza -2-Desoxycytidin
KLF:
Krüppel-like factor
M Cytosin:
methylierter Cytosin
U Cytosin:
unmethylierte Cytosin
U /M Cytosin:
Mischung aus unmethylierte und methylierte Cytosine
Erklärungen
Bestätigung dieser Studie
wurde von JSPS KAKENHI Grantnummer 26462859 unterstützt wird und unter einem Lehrplan der Forschung für das Leben Dental Science an der School of Life Dentistry in Tokyo, The Nippon Dental University. Offene AccessThis Artikel
ist unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution 4.0 Internationale License (http:. //Creative org /Lizenzen /von /4 0 /), die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, Verteilung und Wiedergabe in jeder Voraussetzung hierfür ist, Sie entsprechende Gutschrift an den ursprünglichen Autor (en) und der Quelle geben, einen Link zu der Lizenz Creative Commons zur Verfügung stellen, und zeigen an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Creative Commons Public Domain Dedication Verzicht (http: //Creative org /public /null /1 0 /.), Gilt für die Daten in diesem Artikel zur Verfügung gestellt, sofern nicht anders angegeben
Zusatz. Datei
Zusätzliche Datei 1: Abbildung S1. Methylierungs anfälligen Stellen an KLF4
Gen und dem Promotor. DNA-Sequenz, die in dieser Studie untersucht wird gezeigt (die Sequenz in Exon 1 wird aktiviert). Cytosine potentiell anfällig für Methylierung und ihre numerische Zahl wurden in rot, und ein hypermethylated 237-bps-Region wurde unterstrichen hervorgehoben. Tabelle S1. Eine Zusammenfassung der Methylierung heißt es an jedem Methylierung anfällig Cytosin. (PDF 160 kb) Konkurrierende Interessen
Die Autoren erklären, sie haben keine Interessenkonflikte.
Autoren Beitrag
AY, KK, AT, AS, HA, TH, DU, KY und TC alle Versuche abgeschlossen. TC und KI entwickelt, um die Studie, und KI schrieb das Manuskript. Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.
