Zusammenfassung
Hintergrund
Mundpflege für die orale und systemische Gesundheit wichtig ist, vor allem für ältere institutionalisierte Einzelpersonen und geschwächten Patienten. Allerdings ist die Steuerung herkömmliche mechanische Plaque ist oft schwierig, für diese Patienten wegen der Schmerzen oder der Gefahr von Aspiration. Obwohl antimikrobielle Photodynamischen Therapie (aPDT), die eine Alternative oder Ergänzung zur mechanischen Ansätze betrachtet wird, potentielle Anwendung als weniger belastend Methode der täglichen Plaquekontrolle hat, hat keine klinische Anwendung dieser Technik berichtet.
Methods kaufen Wir die inhibitorische Wirkung einer Kombination von Toluidinblau O (TBO) untersucht, und eine rote Leuchtdiode (LED) auf Zahnplaquebildung bei gesunden Probanden. Die optimale Konzentration von TBO wurde in Vorversuchen in vitro
Experimenten bestimmt die bakterizide Wirkung von aPDT auf Streptococcus oralis
zu bewerten und seine Sicherheit in Fibroblasten-Zellen zu klären. Um den Mechanismus der TBO-vermittelten aPDT Erhebung der Qualität und Quantität von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die während aPDT wurden auch Elektronenspinresonanz (ESR) Spektroskopie untersucht werden. Anschließend wurde die hemmende Wirkung von aPDT auf Zahnplaquebildung in elf Fächer als klinische Pilotstudie untersucht. Die rechten oder linken unteren Prämolaren wurden der Behandlung randomisiert (mit aPDT) oder Kontrolle (ohne aPDT) Gruppen. Insgesamt wurde aPDT sechsmal aufgetragen (zweimal pro Tag) auf die Zähne in der Testgruppe über einen Zeitraum von vier Tagen. Am vierten Tag der Studie abgeschlossen und die Analysen wurden durchgeführt.
Ergebnisse | Eine Kombination von 500 oder 1000 & mgr; g /ml TBO und LED-Bestrahlung für 20 s signifikant die Anzahl der koloniebildenden Einheiten Streptococcus oralis verringert
. Die Zytotoxizität von aPDT war vergleichbar mit der von Standard-Antiseptika in der Mundhöhle verwendet. Hydroxylradikale wurden durch ESR-Analyse nachgewiesen, aber Singulett-Sauerstoff war es nicht. Eine randomisierte kontrollierte Studie zeigte, dass aPDT mit 1000 ug /ml TBO und rote LED-Bestrahlung deutlich Zahnplaquebildung unterdrückt, ohne Zähne oder das umliegende Gewebe zu schädigen.
Schlussfolgerungen
aPDT das Potenzial hat, eine viel versprechende neue technische Modalität für Zahn sein Plaquekontrolle.
Test Anmeldung
dieser Versuch wurde mit der University Hospital Medical Information Network Clinical Trials Registry (Nummer UMIN000012504) registriert.
Schlüsselwörter Antimikrobielle Photodynamischen Therapie Rotes Licht emittierende Diode Toluidinblau O Dental Plaquekontrolle Hydroxylzahl radikale Randomisierte kontrollierte Studie elektronische ergänzendes Material
die Online-Version dieses Artikels (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-152) enthält zusätzliches Material, das autorisierten Benutzern zur Verfügung
Hintergrund
Antimicrobial Photodynamischen Therapie (aPDT) ist ein Verfahren, in dem Sauerstoff-abhängige Aktivierung eines Photosensibilisators mit Licht (hauptsächlich Laser) führt zur Erzeugung von zytotoxischen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Vor kurzem wurde dieses Verfahren in der medizinischen [1, 2] und Zahn eingeführt [3-6] Feldern. Neben der Bestätigung seiner antimikrobiellen Potential in vitro
[7, 8] haben frühere klinische Studien die Anwendung von aPDT zur Behandlung von Akne vulgaris in der Dermatologie ausgewertet [9] und der periodontalen [10, 11], endodontische [12 , 13], und periimplantärer [14] Krankheit in der Zahnmedizin. da es ferner licht erzeugten Verbindungen verwendet, kann aPDT der Lage sein, multiresistente Bakterien zu beseitigen, ohne die Entstehung weiterer Widerstand in diesen Bakterien zu beeinflussen [15].
Beweise Erhöhung besteht, dass die Mundpflege für die systemische Gesundheit wichtig ist, vor allem in geschwächten Patienten. Zuvor Yoneyama et al
. berichtet, dass eine gute Mundpflege das Risiko einer Lungenentzündung und die Rate der Sterblichkeit bei älteren institutionalisierte Individuen [16, 17] senkt. Abe et al
. auch vorgeschlagen, dass die Mundhygiene bei der Prävention von Influenza [18] wirksam war. Die US-amerikanischen National Institutes of Health (NIH) hat empfohlen, dass "alle Krebspatienten vor Beginn der Krebstherapie eine mündliche Prüfung haben sollte, und die Behandlung von bereits existierenden oder die gleichzeitige orale Krankheit ist wichtig, bei der Minimierung von oralen Komplikationen bei allen Krebspatienten" [19 ]. Herkömmlicherweise mechanische Werkzeuge wie eine Zahnbürste, Zahnseide oder Schwamm Pinsel, um die Entfernung von Zahn bakterielle Plaque erreichen. Jedoch ist die mechanische Plaquekontrolle technisch anspruchsvoll und kann für Patienten mit einer verminderten Bereich von Armbewegung oder einen medizinischen Zustand körperlich anstrengend sein, die sie von Aufrechterhaltung einer guten Mundhygiene verhindert. Daher könnte die Anwendung eines nicht-mechanische Mittel zum Steuern dental plaque Bildung von breiten Interesse sein.
1993, Wilson et al
. [20] aPDT als Alternative zu pharmazeutischen und mechanische Mittel zur Beseitigung bakterieller Zahnplaque vorgeschlagen. Jedoch gibt es keine klinischen Berichte über die Verwendung von aPDT als vorbeugende Mundpflege Verfahren zur Bekämpfung von Zahnplaquebildung. Wenn aPDT als neue Methode verwendet werden könnte, Zahnplaquebildung zu steuern, kann Patienten in der Lage sein, eine effiziente Mundpflege zu erhalten, ohne die unangenehmen Spannungen, die herkömmliche mechanische Zahnreinigung zu begleiten, wie Blutungen oder Schmerzen.
Entsprechend wollten wir untersuchen die hemmende Wirkung von aPDT in der Mundhöhle von gesunden Probanden als Pilotstudie, vor der klinischen Studie tatsächlichen Patienten. Wir konzentrierten uns auf Toluidinblau O (TBO), das ein klassisches Photosensibilisator Phenothiazinium Salz ist, weil seine bakterizide Wirkung schon in früheren geklärt wurden in vitro
Untersuchungen [8, 21-23] sowie bei der Behandlung von Periodontitis [4]. Ferner haben die bakterizide Wirkung von TBO-vermittelten aPDT mit High-Power-rote Leuchtdiode (LED) auf zwei typische parodontopathogene Bakterien, Porphyromonas gingivalis
und Aggregatibacter actinomycetemcomitans
, auch in vitro
nachgewiesen [ ,,,0],3].
Vor der Pilotstudie an gesunden Probanden, die antimikrobielle Wirkung von aPDT auf Streptococcus oralis (S. oralis), Frankreich einer der typischen fakultativ anaeroben Bakterium im menschlichen Zahnbelag, und die zytotoxische Wirkung von aPDT auf Fibroblasten wurden in vitro
sucht. Ferner wurde durch Elektronenspinresonanz untersucht die Charakterisierung von ROS erzeugt während aPDT Behandlung (ESR)
Methods
Experiment. 1: In vitro
Bestimmung der bakteriziden Wirkung von aPDT auf Streptococcus oralis
bei 37 ° C unter aeroben Bedingungen; Herstellung von Bakterienplanktonischen Suspension
S. oralis
607 OMZ wurde auf Blutagarplatten (Eiken Chemical Co. Ltd., Tochigi, Japan E-MP23) gehalten. Eine Impföse jeder Stamm wurde in 9 ml Hirn-Herz-Infusion (BHI) Brühe eingeimpft und anaerob bei 37 ° C für 16 Stunden inokuliert. Danach wurden 500 & mgr; l der Bakterienzellsuspension wurde in 5 ml frische BHI-Brühe überführt und weiter anaerob für etwa 5 h bei 37 ° C inkubiert. Schließlich ist eine bakterielle Suspension von 10 8 Zellen /ml wurde unter Verwendung einer Zählkammer verwendet und auf Eis bis zum Gebrauch aufbewahrt.
Photosensibilisator und Lichtquelle
Toluidinblau O (TBO) Pulver (maximale Absorption = 626 nm, Sigma, St. Louis, MO) wurde in Konzentrationen von 100, 500 und 1000 ug /ml in steriler Kochsalzlösung gelöst. Ein Prototyp High-Power-LED rot Gerät (aktive Elemente = AlInGaP, Wellenlänge = 600-700 nm, Peakwellenlänge = 660 nm, Leistungsdichte = 1,1 W /cm 2, spot size = 9 mm auf der Geräteseite, modifizierte von PenCure ™ mit einem 660-nm-Band Deep Red LED [LZ1-00R205; LedEngin, Inc., Santa Clara, CA]. von J Morita Mfg Kyoto, Japan) wurde als Lichtquelle verwendet. Die Bestrahlungszeit der LED wurde auf 20 s festgelegt, entsprechend den Ergebnissen unserer früheren in vitro
Studie [3], die wirksame Bakterienabtötung zeigte die TBO-vermittelte aPDT Verfahren mit 20 s Bestrahlung verwenden.
Lethal photosensitization
eine 30-ul-Aliquot der bakteriellen Suspension wurde mit Kochsalzlösung oder einem gleichen Volumen von TBO-Lösung bei verschiedenen Konzentrationen gemischt (100, 500, und 1000 & mgr; g /ml) in den Vertiefungen einer sterilen 96-Well-Flachbodenplatte (Falcon®; Becton Dickinson Co., NJ). Die Endkonzentrationen von TBO in der gemischten Lösung waren 50, 250 und 500 ug /ml. Nach Inkubation bei Raumtemperatur für 20 s, wurde LED-Bestrahlung für 20 s durchgeführt. Die Licht emittierende Ende (Durchmesser = 8 mm) der LED mit der Öffnung des Schachtes (Durchmesser = 7 mm) während der Bestrahlung entsprechen, wurde aufgestellt. Der Abstand zwischen der oberen Oberfläche der gemischten Bakteriensuspension und dem lichtemittierenden Ende betrug 7 mm, und die Tiefe der gemischten Lösung betrug 3 mm. Die tatsächliche Leistung an der Bakteriensuspension Oberfläche betrug 310 mW, und die Leistungsdichte berechnet wurde 0,94 W /cm 2 (Gesamtenergie 6,2 J für 20 s Bestrahlung) zu sein. Jede Bakteriensuspension wurde individuell auf LED Bestrahlung nach Herstellung der Suspension in jede Vertiefung ausgesetzt. Insgesamt 7 Versuchsgruppen (Exposition gegenüber 100, 500, 1000 ug /ml TBO nur, eine Kombination von TBO und 20 s LED-Bestrahlung und 20 s LED-Bestrahlung nur) und einer unbehandelten Kontrollgruppe für jeden gut vorbereitet wurden.
Nach der Behandlung wurde 10 ein 10-ul-Aliquot aus jeder Vertiefung seriell verdünnt 10.02 5-fach mit Salzlösung und 10 ul der verdünnten Proben wurden in dreifacher Ausfertigung auf Blutagarplatten plattiert. Alle Verfahren, einschließlich der Lösungsherstellung, Bestrahlung und Plattieren Proben wurden auch individuell für jede durchgeführt (das heißt eines nach dem anderen). Die 96-Well Platten wurden für 48 h unter aeroben Bedingungen bei 37 ° C inkubiert, und die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (KBE) bestimmt. Das Experiment wurde unabhängig fünfmal wiederholt
Experiment. 2: zytotoxische Wirkung von aPDT auf Fibroblasten
Zellkultur
Maus-Fibroblasten-Zelllinie L929 (Riken, Saitama, Japan) in 75 cm kultiviert 3 Gewebe Kulturflaschen in 20 ml RPMI 1640-Medium (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan), enthaltend 100 U /ml Penicillin, 100 U /ml Streptomycin und mit 2,5 mmol /l L-Glutamin und hitzeinaktiviertem 5% fötales Kälberserum (Gibco ergänzt ®)
Zellbehandlung
1 x 10 4-Zellen wurden in jede ausgesät und von 96-Well-schwarz-Testplatten (klar flachen Boden;. Costar®, Corning, NY), und bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für 48 h, bis die Zellmonoschicht wurde konfluent.
für Versuchsgruppen nach Entfernung des Mediums, 100-ul TBO (100, 500 oder 1000 & mgr; g /ml) zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Zellen wurden für 20 s inkubiert und die TBO Lösung wurde dann aus allen Vertiefungen abgesaugt. Nachdem die Zellen zweimal mit 100 ul PBS gewaschen wurden, wurden 100 ul Medium in die Vertiefung gegeben, und sofort wurde die Zelle auf LED-Licht von der Oberseite der Platte auf 0,94 W /cm 2 für 20 s ausgesetzt ( Gesamtenergie = 6,2 J). Die Kontrollen waren entweder unbehandelt oder mit TBO behandelt (100, 500 und 1000 & mgr; g /ml) allein, und wurden zweimal mit PBS gewaschen.
Die Gruppe der mit 1000 & mgr; g /ml TBO und LED-behandelten Zellen wurde mit einem im Vergleich (; Yoshida Pharmaceutical Co. Ltd., Saitama, Japan Oxydol) oder 0,025% Benzalkoniumchlorid (OSVAN®; Nihon Pharmaceutical Co. Ltd., Tokyo Gruppe von Zellen, die mit 2,5 bis 3% H 2 O 2 behandelt Japan,), die die Standard-Antiseptika für Mundschleimhaut sind. Die Zellen wurden in H 2 O 2 und Benzalkoniumchlorid für 20 s belichtet und zweimal mit PBS gewaschen. Alle Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung und wiederholt fünfmal durchgeführt.
Zytotoxizitätstest
einem kolorimetrischen Assay die Tetrazoliumverbindung 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- enthaltend (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium, inneres Salz; MTS (CellTiter 96 ® Wässrige Lösung One Cell Proliferation Assay, Promega, WI), wurde verwendet, die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen [21]. Etwa 100-ul-Aliquote des Wachstumsmediums und 20 & mgr; l MTS-Reagens wurden zu jedem Loch zugegeben. Nach Inkubation für 2 h bei 37 ° C in einer 5% CO 2 -Inkubator wurde die Extinktion jeder Vertiefung wurde bei 490 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegerät gemessen, und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde berechnet
Experiment. 3: Analyse von ROSs erzeugt während wurde für die qualitative und quantitative Auswertung von ROS erzeugt während aPDT aPDT
ESR-Spektroskopie verwendet. Die Spin-Trap-Reagenzien 2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinol (4-OH-TEMP; 98% Reinheit; Sigma) und 5,5-dimethyl-1-pyrrolin-N
-oxid (DMPO ; Dojin Chemicals, Kumamoto, wurden jeweils für Singulett-Sauerstoff und Hydroxyl-Radikal-Erkennung, Japan) verwendet. Ein Gemisch aus 800 & mgr; l PBS, 100 & mgr; l-1000 & mgr; g /ml TBO und 100 & mgr; l 4-OH-TEMP wurde zur Messung von Singulett-Sauerstoff verwendet wird. Ein Gemisch aus 400 & mgr; l PBS, 50 & mgr; l 50 mM DMPO und 50 & mgr; l von 1000 & mgr; g /ml wurde verwendet, TBO Hydroxylradikale zu messen. Die Messungen wurden für 20 s nach der Übertragung der Mischungen zu einem Quarz flachen Küvette und Kontakt mit der roten LED-Licht erhalten. Die Messung wurde unter Verwendung von ESR (JES-RE 3X, JEOL, Tokyo, Japan) durchgeführt mit einer WIN-RAD ESR Data Analyzer (Radical Forschung, Tokyo, Japan) bei den folgenden Geräteeinstellungen: Mikrowellenleistung = 8 mW, Magnetfeld = 335,8 mT, Modulationsbreite = 0,079 mT, Zeit = 1 min fegen, und die Zeitkonstante = 0,03 s. Alle Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung bei Raumtemperatur durchgeführt
Experiment. 4: Hemmung Wirkung von aPDT auf Zahnplaquebildung
Eine offene randomisierte single-blind-Studie mit Split-Mouth-Design (jeder Proband erhielt Test- und Kontrollanwendungen, die jeweils auf einer separaten Seite des Mundes) wurde durchgeführt, um die inhibitorische Wirkung auf aPDT Zahnplaquebildung (Figur 1) zu untersuchen. Abbildung 1 Consort Flussdiagramm der klinischen Studie über die Wirksamkeit von aPDT zur Hemmung der Zahnbelag.
Themen
Diese klinische Studie wurde von der Ethikkommission der Fakultät für Zahnmedizin, Tokyo Medical and Dental University (TMDU) (Nr 836) zugelassen und wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Diese Studie wurde mit der University Hospital Medical Information Network Clinical Trials Registry (Nummer UMIN000012504) registriert und wurde nach dem CONSORT Richtlinien für klinische Studien Weitere Datei 1. Die Rekrutierung von Probanden und Experiment durchgeführt wurden von Januar 2013 bis Februar 2013 in der Abteilung für Parodontologie durchgeführt Dental Hospital von TMDU.
Elf Freiwillige Zahnärzte wurden für diese Studie rekrutiert, und informierte Zustimmung wurde von allen Teilnehmern erhalten. Die Themen waren sieben Männer und vier Frauen, im Alter von 26-33 Jahren (Mittelwert = 28,0 ± 2,3 Jahre). Einschlusskriterien für die Fach Einschreibung enthalten gute allgemeine Gesundheit, keine antimikrobielle Aufnahme in den letzten drei Monaten, um die Anwesenheit von mindestens 20 Zähne, die normale Eruption aller unteren Prämolaren, das Fehlen von Schwellung oder Rötung der Gingiva, und das Fehlen von Websites mit Sondierungstiefe ≥ 4 mm.
Probengröße Berechnung
Die Stichprobengröße wurde unter Verwendung einer statistischen Aussagekraft von 80%, Typ-I-Rate von 5% Fehler berechnet, und eine angenommene Differenz von 10% und SD von 10% mit die Werte der Plaque-Ablagerungsbereich. Auf der Grundlage dieser Daten ist die Zahl der Frage zu führen, diese Studie erforderlich als 10. Allerdings berechnet wurde, die Möglichkeit, unter Berücksichtigung einer Drop-out-Thema hat, Einschreibung von 11 Teilnehmern geplant war.
Die aPDT Verfahren
die ersten und zweiten Prämolaren auf der linken und rechten Seite des Unterkiefers wurden ausgewertet. Die Auswahl der Zähne wurde am Standort basiert, und die Eignung für LED-Bestrahlung, Fotografieren, und die Probenentnahme sowie Plaqueanlagerung die Studienbedingungen. Die klinische Studie wurde an vier Tagen durchgeführt wird, beginnt und endet am Abend (Abbildung 1). Am ersten Tag wurde der Zahnbelag auf den bukkalen und lingualen Oberflächen der unteren Prämolaren auf beiden Seiten aufgebracht rot gefärbt mit einer Plakette Enthüllen von Lösung (ProSpec®; GC, Tokyo, Japan). Die supra- und subgingivale Plaque wurde dann durch eine professionelle Zahn gründlich entfernt Reinigung (PZR) auf einem Mikromotor Handstück ein Ultraschall-Scaler, sowie eine Gummikappe und eine Kegelform Bürste angebracht werden.
Anschließend das Recht oder linke Seite Prämolaren wurden zufällig für die Behandlung zugewiesen (mit aPDT) oder als nicht-behandelten Kontrollgruppe (ohne aPDT) durch den Umschlag-Verfahren, bei dem die Teilnehmer einen undurchsichtigen Umschlag zufällig ausgewählt, um eine Notiz Zuteilung der Behandlungsseite (rechts oder links) enthält. TBO (1 mg /ml) wurde zu den bukkalen und lingualen Oberflächen der Zähne Testgruppe unter Verwendung einer kleinen Baumwollpellet vorsichtig aufgetragen. Nach 10 s wurde TBO durch Ausspülen des Mundes weggewaschen. Nach dem Waschen LED wurde 20 s in einem 90 ° -Winkel auf jeder bukkalen und lingualen Fläche jedes Zahnes fokussiert, in einer Gesamtbestrahlungszeit von 80 s auf den vier Flächen von zwei Prämolaren in jeder Behandlungssitzung (Figur 2) führt. Insgesamt wurde aPDT sechsmal aufgetragen (zweimal pro Tag, einmal morgens und einmal abends) an die Testgruppe Zähne für vier Tage. Während der Probezeit wurden die Teilnehmer von Bürsten der Prämolaren und die benachbarten Zähne verboten, und von Mundwasser. Am vierten Tag der Studie abgeschlossen und Analysen wurden durchgeführt. Abbildung 2 Fotografien des aPDT klinischen Verfahrens zeigt. (A) Vor aPDT. (B) Nach der anfänglichen Entfernung des Zahnbelags (vor dem ersten aPDT Verfahren). (C) während der Anwendung von TBO. (D) Nach der Anwendung von TBO und Mundspülung. (E) Bei der Bestrahlung LED. (F) Nach LED-Bestrahlung.
Bestimmung der Fläche des Zahnbelags Abscheidungs
Nachdem die Zahnoberflächen mit einer Plaque-Offenlegung Lösung gefärbt wurden, die bukkalen und lingualen Seite des ersten und des zweiten Prämolaren in der Behandlung und Kontrolle Gruppen wurden in einem 90 ° Winkel zur Zahnoberfläche photographiert. Die lingualen Fotografien wurden mit einem Spiegel vor allem für Kiefer lingual Fotografie (Fotografie-Spiegel ST für Lingual 13262, YDM Corp., Tokio, Japan) entworfen genommen. Die rote Farbe gefärbten Bereich der Zahnplaqueablagerung sowie der Bereich der gesamten Zahnoberfläche auf der bukkalen und lingualen Seiten wurde auf den Fotografien bestimmt, ein Software-Programm (Photoshop CS5 Extended, Adobe Systems Inc., CA). Zu Interobserver- Variabilität, die Bestimmung der Bereiche reduzieren wurde den Versuchsgruppen (A. A. und Y. T.) und der Durchschnitt der beiden Messungen wurde als die repräsentative Flächenwert von jedem Standort verwendet verblendet von zwei Prüfern unabhängig für jede Seite durchgeführt wird. Der Prozentsatz der Fläche der Plaque-Ablagerung bezogen auf die gesamte Zahnoberfläche berechnet.
Bestimmung der Anzahl von Bakterien im Zahnbelag von der lingualen Oberfläche des zweiten Prämolaren gesammelt
Die linguale Oberfläche der zweiten Prämolaren ausgewählt wurde als die repräsentative Stelle für Plaque-Sammlung, weil die linguale Oberfläche der Regel konstantere Plaqueansammlung als die bukkale Oberfläche aufweist, und der zweite Prämolar hat eine größere Oberfläche als die linguale ersten Prämolaren. Supragingivale Plaque-Proben wurden mit einer Gracey Kürette von der lingualen Oberfläche des zweiten Prämolaren vor der Behandlung (Basislinie) gesammelt, und 4 Tage nach Beendigung der klinischen Prüfung durch verblendet Prüfer (A. A. Y. oder T). , die für die schnelle Zählung eine große Anzahl von Bakterien geeignet war, die Zahl der Bakterien wurde unter Verwendung eines bakteriellen Zähler verfügbar am Lehrstuhl Seite (Panasonic Healthcare, Tokyo, Japan Schnelle orale Bakterien-Erfassungsvorrichtung) gemessen. Die Zählvorrichtung die dielektrophoretische Impedanzmessverfahren eingesetzt, die eine gute Korrelation mit dem herkömmlichen Kultivierungsverfahren [24].
Statistical analysis
Daten aus dem ersten Experiment zu demonstrieren wurde berichtet wurden unter Verwendung der Varianzanalyse (ANOVA) ausgewertet von Dunnett-Test gefolgt. Der Einfluss von TBO und LED-Bestrahlung auf Fibroblasten wurde analysiert unter Verwendung von Zwei-Wege-faktoriellen ANOVA, gefolgt von Tukey-Test. Der Vergleich der kombinierten Anwendung von 1000 & mgr; g /ml TBO und LED-Bestrahlung mit den beiden bekannten Antiseptika wurde mit ANOVA durchgeführt, während die Menge von ROS erzeugt während aPDT wurde ein t
-Test analysiert. Die Daten aus dem vierten Experiment wurden analysiert unter Verwendung eines gekoppelten t
-test. Alle Analysen wurden unter Verwendung des Statistik-Software-Programm JMP 8.0 (SAS Institute, Cary, NC), mit Ausnahme der Zweiwege-faktoriellen ANOVA durchgeführt, die von PASW 18,0 (SPSS, IBM, Tokyo, Japan) durchgeführt wurde. Ein P
& lt; 0,05 wurde für alle Analysen statistisch signifikant betrachtet
Ergebnisse | Experiment 1:. Bakterizide Wirkung von aPDT auf S. oralis in vitro
In den entweder mit LED oder TBO allein behandelten Gruppen, die Anzahl der CFU sich nicht von denen der unbehandelten Kontrolle unterscheiden. Umgekehrt Gruppen, die TBO + LED empfangenen zeigten Zahlen CFUs, die signifikant niedriger bei 500 und 1000 & mgr; g /ml waren (P
& lt; 0,01 und P
& lt; 0,05), verglichen mit der Kontrolle. Die niedrigste Zahl an CFU wurde in der Gruppe mit 500 ug /ml TBO + LED (1,42 log-Reduktion, 96,2% Abtötung, Abbildung 3) behandelt wurden, beobachtet. 3 In-vitro-Bakterienreduktion Effekte von aPDT mit TBO und LED auf S. oralis. Blaue Balken zeigen die Wirkung von TBO nur und roten Balken zeigen die Wirkung von TBO mit LED-Bestrahlung. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD (n = 5)
Experiment. 2: zytotoxische Wirkung von aPDT auf Fibroblasten
TBO allein eine dosisabhängige Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen verursacht. Zwei-Wege-faktoriellen ANOVA ergab, dass LED, TBO und TBO + signifikant die Lebensfähigkeit der Zellen reduziert LED (P
& lt; 0,01). Darüber hinaus verbessert die Anwendung von LED zu allen Konzentrationen von TBO die Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen (4A). Jedoch war die Lebensfähigkeit der Zellen, die mit 1000 ug /ml behandelt TBO und LED-Bestrahlung nicht signifikant verschieden von der Lebensfähigkeit der Zellen, behandelt mit 2,5-3% H 2 O 2 oder 0,025% Benzalkoniumchlorid (4B). Abbildung 4 zytotoxischen Wirkungen von aPDT auf Fibroblasten. (A) Die Wirkung von TBO Konzentration auf die Lebensfähigkeit der Zellen. (B) Vergleich der Lebensfähigkeit der Zellen zwischen aPDT und Standard Antiseptika. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD (n = 5)
Experiment. 3: Analyse von Ross während aPDT erzeugt
keine signifikanten Unterschiede in der Produktion von Singulett-Sauerstoff zwischen dem PBS bestand + LED und die TBO + LED-Gruppen (Abbildung 5A). wenn jedoch im Vergleich zur Kontrolle, Radikal die Herstellung von Hydroxyl war signifikant höher in der TBO + LED-Gruppe (P
& lt; 0,01, 5B). Die spezifische DMPO-OH Spinadduktes, die die Produktion von Hydroxylradikalen beweist, wurde in der TBO + LED-Gruppe (6) beobachtet. Abbildung 5 ROSs während der TBO-vermittelten aPDT Verfahren nachgewiesen werden. (A) Singulett-Sauerstoff. (B) Hydroxylradikal.
Abbildung 6 Typisches Spektrum ESR während TBO-vermittelten aPDT Verfahren.
Experiment 4: Hemmung Wirkung von aPDT auf Zahnplaquebildung
keine systemischen oder lokalen Komplikationen nach aPDT Anwendung während des Versuchszeitraums beobachtet wurden. Die Restblaufärbung auf dem Zahnfleisch folgende TBO Anwendung war makroskopisch nicht sichtbar ist, und wurde erst unmittelbar nach der Anwendung festgestellt. Die Färbung war sowohl minimal als auch zeitlich begrenzt, und verursacht keine ästhetischen Probleme für die Fächer.
Die Plaquebildung auf den Zähnen aPDT Gruppe wurde offensichtlich nach dem Tag vier von aPDT gehemmt, die in repräsentativen intraorale Fotografien (Abbildung 7) offensichtlich war. Der prozentuale Anteil der Plaqueablagerung Bereiche Gesamtmund (8A) und lingualen Zahnoberflächen (8B) wurden in der aPDT-Gruppe signifikant reduziert (buccal = 14 ± 9,1% und lingualen = 12 ± 5,4%, Mittelwert ± SD, jeweils), im Vergleich zu der Kontrollgruppe (buccal = 25 ± 13% und lingualen = 21 ± 7,0%, p
& lt; 0,01). Abbildung 7 Ergebnisse einer klinischen Studie über die Wirksamkeit von aPDT zur Hemmung der Zahnbelag. Fotografien von unteren Prämolaren des Subjekts # 6 nach aPDT. Bukkalen (A) oder lingual (C) Oberfläche aPDT Gruppe Zähne und Wangen (B) oder lingual (D) Oberfläche der Kontrollzähne.
Abbildung 8 Das Verhältnis der Plaque dampfte Fläche zur Gesamtfläche von Mundschleimhaut ( A) und lingualen (B) Zahnoberfläche in unteren Prämolaren.
wurden keine signifikanten Unterschiede zu Beginn der Studie zwischen dem aPDT Gruppe (6,17 ± 0,38 log) und der Kontrollgruppe festgestellt (6,29 ± 0,39 log; P
= 0,49) in der Gesamtzahl der Bakterien im Zahnbelag aus den gesammelten linguale Oberfläche des zweiten Prämolaren. Allerdings war die Gesamtzahl der Bakterien im Zahnbelag signifikant niedriger 4 Tage nach der klinischen Studie in der aPDT-Gruppe (6,17 ± 0,49 log) im Vergleich zu der Kontrollgruppe (6,68 ± 0,48 log; P
& lt; 0,01; Abbildung 9). Figur 9 die Anzahl der Bakterien im Zahnbelag von dem zweiten Prämolar gesammelt. Reise Beiträge
Unseres Wissens ist dies die erste klinische Studie ist es, die Wirksamkeit von aPDT bei der Hemmung der Zahnplaquebildung auf den Zähnen zu zeigen, ohne schädliche Wirkungen zu induzieren Gewebe zu bewirten. Ferner bestätigt diese Studie, dass TBO mit roten LED effektiv die Bakterien S. oralis reduziert
, die als Anfangs Kolonisator in Zahnplaquebildung bekannt ist, und oft im Blut von Patienten, die von der infektiösen Endokarditis leiden erkannt wird [25, 26]. Die Verwendung von TBO mit einem High-Power-LED-Gerät und eine 20 s Bestrahlungszeit, führte zu einer signifikanten dosisabhängige Verringerung der CFU in vitro
. wurde jedoch war die Reduktion weniger als 1000 & mgr; g /ml TBO (Endkonzentration von 500 ug /ml) verwendet, als wenn 500 ug /ml (Endkonzentration von 250 ug /ml) aufgetragen wurde. Eine mögliche Erklärung war die Tatsache, daß die blaugefärbten 1000 & mgr; g /ml TBO gemischte Bakterienlösung zu dunkel war für das rote Licht auf der Unterseite der Platte mit 96 Vertiefungen durch die Lösung durchdringen und so die Sensibilisierung von TBO durch LED-Bestrahlung wurde möglicherweise blockiert. Dennoch wurde 1000 ug /ml TBO verwendet, da in klinischen Situationen, die sofortige Verdünnung von TBO mit Speichel und seine oberflächliche Ausbreitung auf der Zahnoberfläche zu einer effizienteren Licht Sensibilisierung von TBO führen könnte als Zeuge in vitro
. In der vorliegenden Studie lag der Fokus nur auf S. oralis
; jedoch besteht die Bildung von Zahn Biofilm von unterschiedlichen primären Kolonisatoren und komplexe inter mikrobiellen Wechselwirkungen. Daher sollten verschiedene andere Plaque-bildenden Bakterien, einschließlich Actinomyces viscosus und Streptococcus sanguis
in zukünftigen Studien untersucht werden. Im Hinblick auf die Sicherheit des Verfahrens
allein TBO negativ auf die Lebensfähigkeit von Fibroblasten in einer konzentrations- beeinflusst abhängig, und die Anwendung der LED verbessert die Wirkung. Jedoch ist die in vitro
Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen unter den gegenwärtigen Bedingungen aPDT (1000 & mgr; g /ml TBO mit 20 s LED-Bestrahlung) nicht überstieg, dass mit anderen Antiseptika beobachtet, was zeigte, dass die Zytotoxizität von aPDT innerhalb der herkömmlichen Niveaus war . Dazu kommt, obwohl vorherige Berichte haben die Resistenz von Bakterien zu Antiseptika, wie Benzalkoniumchlorid angegeben, die ein quaternäres Ammonium kationisches Tensid ist, die die Lipidmembran der Zellen unterbricht [27, 28], das Fehlen von bakterieller Resistenz nach Anwendung von aPDT wäre eine andere sein, nutzen in klinischen Anwendung [29]. In der vorliegenden Studie haben wir jedoch nur beobachtet, akute Zytotoxizität bei 2 h nach einmaliger Anwendung von aPDT und damit weitere Studien die langfristige Einfluss von aPDT auf die Zellproliferation zu untersuchen erforderlich, sowie die kumulative Wirkung bei wiederholter Anwendungen.
die Analyse von ROS erzeugt während TBO-vermittelte aPDT in der neuen Erkenntnis geführt, dass das Hydroxyl-Radikal das Hauptprodukt war. Obwohl der Mechanismus der aPDT [30] Es wird angenommen, im Allgemeinen durch eine Art stattzufinden ich verarbeiten, die durch Elektronenübertragung ein Hydroxyl-Radikal erzeugt, oder ein Typ-II-Prozess, der durch Energieübertragung von Singulett-Sauerstoff liefert, die von TBO keine Modalität des Zelltods vermittelter aPDT wurde geklärt. Singulett-Sauerstoff wird als die Haupt schädlichen Spezies in aPDT angesehen [31], und die gemeinsame Photosensibilisator Methylenblau ist ein bekannter Hersteller von Singulett-Sauerstoff. In unserer früheren Pilotstudie (Daten nicht gezeigt), konnten wir bestätigen, die Produktion von Singulett-Sauerstoff in Methylenblau-vermittelte aPDT. Allerdings ESR-Analyse ergab eindeutig, dass das Hydroxyl-Radikal das vorherrschende Produkt von TBO-vermittelten aPDT war. Ferner wurde Typ I Maschinen spekuliert, eine wichtige Rolle in diesem aPDT Verfahren zu spielen.
Die Ergebnisse der in vitro Nach
Experimenten haben wir versucht, die klinische Anwendung von aPDT zur Hemmung der Zahnplaquebildung und beobachtet ein signifikante Unterdrückung der Plaque-Ablagerung auf den Zähnen mit aPDT behandelt. Die viertägige Dauer der klinischen Studie war kurz, und damit eine längere Dauer war erwünscht. Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.
