Zusammenfassung
Hintergrund
Es ist allgemein bekannt, dass die Verwendung von Prothesenreiniger Candida reduzieren können albicans
Biofilm Akkumulation; jedoch ist die Wirksamkeit von Gebissreinigern Citronensäure unsicher. Darüber hinaus ist die langfristige Wirksamkeit dieser Gebissreinigungs nicht gut etabliert, und ihre Wirkung auf die Rest Biofilmen ist unbekannt. Diese in vitro
Studie die Wirksamkeit von Zitronensäure Gebissreinigungsbehandlung auf C. albicans
Biofilm Rekolonisierung auf Poly (methylmethacrylat) (PMMA) Oberfläche bewertet.
Methods
C. albicans
Biofilmen wurden 72 h auf PMMA-Harz Proben entwickelt (n = 168), die über Nacht auf 1 von 3 Reinigungsbehandlungen (CTs) wurden randomisiert (8 h). CTs enthalten gereinigtem Wasser als Kontrolle (CTC) und zwei Versuchsgruppen, die entweder verwendet, um eine 1: 5 Verdünnung von Gebissreinigungs Citronensäure (CT5), oder einer 1: 8-Verdünnung von Citronensäure Gebissreinigungs (CT8). Rest Biofilmen auf die Proben haften, wurden gesammelt und zu zwei Zeitpunkten quantifiziert: sofort nach CTs (ICT) und nach der Reinigung und Rest Biofilm Rekolonisation (RT). Rest Biofilme wurden durch Quantifizierung der lebensfähigen Zellen (CFU /ml) analysiert und Biofilmarchitektur wurde durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) und Rasterelektronenmikroskopie (SEM) bewertet. Gebissreinigungsbehandlungen und Bewertungsperioden wurden Studie Faktoren berücksichtigt. Die Daten wurden mittels analysiert Zwei-Wege-ANOVA und Tukey ehrlich signifikante Differenz (HSD) Test (α = 0,05).
Ergebnisse
Unmittelbar nach Behandlungen, Zitronensäure Gebissreinigungslösungen (CT5 und CT8) reduzierte die Zahl der lebenden Zellen im Vergleich mit der Kontrolle (p & lt; 0,01). Jedoch nach 48 h, wobei beide CT-Gruppen (CT5 und CT8) zeigte Biofilm Rekolonisierung (p & lt; 0,01). Rest Biofilm Rekolonisation wurde auch durch CLSM und SEM-Analyse nachgewiesen, die eine höhere Biomasse und mittlere Biofilmdicke für die CT8 Gruppe ergab (p & lt; 0,01).
Fazit
Zitronensäure Zahnersatz Reiniger C. albicans zu reduzieren
Biofilmbildung und die Lebensfähigkeit der Zellen. Allerdings verhindern diese CT nicht Biofilm Rekolonisation
Schlüsselwörter Biofilm Gebisshygiene Zahnersatz- Cleansers Candida albicans
Poly (methylmethacrylat) Elektronische Zusatzmaterial
Die Online-Version dieses Artikels (doi:. 10. 1186 /1472-6831-14-77) enthält zusätzliches Material, das autorisierten Benutzern zur Verfügung steht.
Hintergrund
Candida
spp. ist eine der wichtigsten Erreger von denture induzierter Stomatitis, die Biofilme auf Mundhöhle Gewebe und Prothesenoberflächen sowie wegen seiner Beständigkeit gegenüber Antimykotika [1-4] haften und bilden in erster Linie aufgrund seiner Fähigkeit ist. Dieser Biofilm wächst extensiv auf Acrylharz Prothesenmaterial und dessen wirksame Entfernung ist eine große Herausforderung sowohl von chemischen und mechanischen Verfahren [2-5]. Viele chemische Prothesenreinigern
die Enzyme, Natriumhypochlorit, alkalische Peroxid enthalten und Säurelösungen sind für die Verwendung mit mechanischen Bürsten des restlichen Biofilm Prothesenoberflächen [5-8] angebracht zu entfernen. Gebissreinigungslösungen haben antimikrobielle Eigenschaften, wie sie von vielen Studien nachgewiesen [7-12]; jedoch keine dieser Methoden effektiv scheinen den Biofilm zu entfernen und zu verhindern Rekolonisation auf der Prothesenoberfläche [6, 7]. Eine andere Art von Zahnprothesenreiniger
enthält Zitronensäure und ist als eine konzentrierte Lösung, die täglich verwendet werden können ( Verdünnung 1: 5) oder wöchentlich (1: 8-Verdünnung) nach entsprechender Verdünnung (wie vom Hersteller angegeben). Dieser Reiniger wirkt als ein chemotherapeutisches Mittel, die wirksam Biofilme durch einen Maskierungsmechanismus mit Calciumionen [13] stören können. Dieser Mechanismus ermöglicht Zitronensäure Calcium Brücken zu durchbrechen und stören anschließend die Biofilm-Matrix, die auf anti-Biofilmaktivität führen kann [14, 15].
Zitronensäurelösungen wurden auf ihre Fähigkeit bewertet, Implantatoberflächen zu dekontaminieren [16], was zeigt, eine Reduzierung der Anzahl von pathogenen Arten. Obwohl Zitronensäurelösungen gegen
Streptococcus mutans auch wirksam sind Biofilme und aus mehreren Spezies abgeleitet Biofilme, die auf Titanoberflächen entwickeln [16] hat die Wirkung von Citronensäure Reinigern gegen Candida
Biofilmen auf Prothesenoberflächen noch nicht berichtet worden.
Obwohl kontinuierliche Verwendung von Zitronensäure Reiniger für 3 Monate zeigte negative Wirkungen mit größerer Ionenfreisetzung aus Co-Cr-Legierungen [17, 18], keine schädlichen Wirkungen wurden mit Prothesenmaterialien im allgemeinen [19] demonstriert. Im Gegensatz dazu andere Prothesenreinigungsmittel, vor allem Natriumhypochlorit solche, die, könnte Oberflächenrauhigkeit erhöhen, Härte zu verringern und schließlich die Farbe der Acrylharze ändern und Prothesenliner [19-21]. Daher könnte Zitronensäure Reiniger für herausnehmbaren Zahnersatz und kieferorthopädische Geräte geeignet und Biofilmen und die Verhinderung ihrer Wiederbesiedelung zu entfernen.
Daher unter Berücksichtigung der Mangel an Studien, die die Wirksamkeit von Zitronensäure Reiniger Prüfung für Biofilme von Prothesenmaterialien, die vorliegende Studie zu entfernen die Wirksamkeit von Zitronensäure Reiniger auf Candida albicans
Biofilm Rekolonisation ausgewertet auf Poly (methylmethacrylat) (PMMA).
Methoden
Experimentelles Design
dieser in vitro
Studie eine randomisierte, verblindete Design verwendet . C. albicans
Biofilme wurden 72 h auf PMMA-Harz Proben entwickelt (n = 168) und dann zugewiesen zufällig 1 von 3 Reinigungsbehandlungen (CTs): gereinigtes Wasser, verwendet als Kontrolle (CTC); 1: 5-Verdünnung von Citronensäure Gebissreinigungs (CT5); oder 1: 8-Verdünnung von Zitronensäure Zahnprothesenreiniger (CT8). Rest Biofilme Proben haften, wurden gesammelt und zu zwei verschiedenen Zeitpunkten quantifiziert: sofort nach der Behandlung (ICT Gruppe) oder 48 h nach der Reinigung, wenn die Rest Biofilm Rekolonisation (RT-Gruppe) Reinigung auftreten würde. Rest Biofilme wurden durch Bestimmung der Anzahl an lebensfähigen Zellen (CFU /ml) analysiert. Biofilm-Architektur wurde durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) und Rasterelektronenmikroskopie (SEM) bewertet. Die Studie Faktoren waren Gebissreinigungsbehandlungen und Bewertungsperioden (ICT oder RT). Die Reaktionsvariablen waren die Anzahl der lebensfähigen Zellen und die Architektur von C. albicans
Rest Biofilmen. Ein Schema des experimentellen Design wird in den Zusatzdatei 1.
Harzprüfkörper
scheibenförmige Proben (10 mm Durchmesser, 2 mm Dicke und 219,8 mm
2 Fläche) von Mikrowellen polymerisiert PMMA dargestellt ( Onda Cryl; Artigos Odontológicos Clássico Ltd, São Paulo, Brasilien) wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Nach der Polymerisation wurden die Scheiben in gereinigtem Wasser bei 37 ° C für 48 h für Rest Monomerfreisetzung [22] eingetaucht. Die PMMA-Proben wurden gemahlen, dann mit einer horizontalen Poliermaschine (Modell APL-4; Arotec, São Paulo, Brasilien) und immer feiner Aluminiumoxid Papiere unter Verwendung von (320-, 400- und 600-grit) Oberflächenrauhigkeit bei 0,34 ± 0,02 zu standardisieren um. Vor den Biofilm Entwicklung wurden die Scheiben mit Ultraschall gereinigt (Thornton T 740; Thornton-InPEC Eletrônica Ltda, Vinhedo, Brasilien) mit 70% Alkohol und ultra-gereinigtes Wasser sterilisiert (20 min) Verunreinigungen und Artefakte von der Oberfläche zu entfernen [23] . Das Fehlen einer Kontamination durch Eintauchen einer Probe der Proben in sterilen Kulturmedien bestätigt wurde
Die Proben zufällig auf 1 der 3 Behandlung zugewiesen wurden Gruppen, die weiter innerhalb der ausgewerteten Zeitpunkten aufgeteilt wurden. Sofort nach der Behandlung (ICT) und 48 Stunden nach der Reinigung und Rest Biofilm Rekolonisation (RT). Die Anzahl der Proben in jeder Gruppe (n = 12) wurde mit Vorversuchen ermittelt, die die Probengröße bestätigte eine ausreichende Leistung (80%) ergab statistisch signifikante Unterschiede zu erkennen. Speichel- Pellikelbildung
Proben
Vor der Entwicklung die Biofilm-Assays wurden sauber PMMA Proben mit Speichel beschichtet, um die Mundhöhle Umgebung zu imitieren. Menschliches Voll Speichel wurde von einem gesunden Freiwilligen gespendet, die informierte Einwilligung schriftlich zur Verfügung gestellt. Die Forschung und Ethikkommission der Piracicaba Dental School, State University of Campinas, genehmigte diese Studie. Die Speichelprobe wurde in der gleichen Zeit des Tages gesammelt, für jedes Experiment, und das Sammelvolumen wurde auf 50 ml pro Sammelperiode begrenzt
Menschen ganze Speichel wurde von Kau- Stimulation mit flexiblen Folie gesammelt (Parafilm M;. American Can Co , Neenah, WI). Speichels wurde bei 3.800 g
für 10 min bei 4 ° C durch Zentrifugieren geklärt. Der Überstand wurde durch Filtration (22 & mgr; m) für den sofortigen Gebrauch gesammelt und sterilisiert. Für jede Platte wurde ein Speichelbelag auf der Oberfläche nach der Inkubation gebildet für 30 min bei 37 ° C und 75 Umdrehungen pro Minute, in einem Orbitalschüttler.
Inoculum und Wachstumsbedingungen
A Impföse Hefekultur von C. albicans
(ATCC 90028) wurde 24 h bei 37 ° C aktiviert und inkubiert. Danach wurden die Zellen geerntet, suspendiert in Yeast Nitrogen Base (YNB) Brühe (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), ergänzt mit 100 mM Glucose. Die Zelldichte wurde spektrophotometrisch (Spectronic 20; Bausch & amp; Lomb, Rochester, NY) standardisiert auf eine optische Dichte von 0,25 bei 520 & eegr; m, die auf 1 × 10 entsprach 6 CFU /ml Inokulum [24]
Biofilm-Assay.
PMMA Speichel beschichteten Scheiben wurden vertikal in 24-Well-Kulturplatten Polystyrol gegeben. Anschließend wurden 2 mL der standardisierten Zellsuspension (1 × 10 6 CFU /ml von C. albicans
in YNB mit Glucose 100 mM supplementiert) wurde zu jeder Vertiefung zugegeben. Biofilm wurde bei 37 ° C entwickelt und unter 75 rpm in einem Schüttler für 72 h, Biofilm Reifung zu ermöglichen. Das Medium wurde alle 24 h gewechselt. Biofilm-Assays in dreifacher Ausführung in 3 unabhängigen Experimenten durchgeführt.
Behandlungsprotokolle für 72 h Nach der Biofilmwachstum
wurden die Proben nach 1 von 3 CTs über Nacht randomisiert (8 h). Zitronensäure Reiniger (CURADEN BDC 105, Curaprox, CH) wurde in gereinigtem Wasser verdünnt, gemäß den Anweisungen des Herstellers, in 1: 5 oder 1: 8-Lösungen, die für die wöchentliche oder tägliche Anwendung empfohlen sind. Jede Probe in einem sterilen Becherglas gegeben wurde, die 8 ml der Behandlungslösung.
Nach Reiniger-Behandlungen (8 h) wurden die Proben entfernt und zweimal in 2 ml sterilisiertem phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) -Lösung (pH 7,4) . Die Rest Biofilmen auf die Proben haften wurden sofort gesammelt (ICT) oder unter den gleichen Bedingungen erlaubt für 48 Stunden (RT-Gruppe) [10] zu wachsen. Führbare Zelle Quantifizierung von Rest Biofilm Bei
Rest Biofilme wurden gestört und geklebt Mikroorganismen wurden aus Proben durch Beschallung (7 W für 30 s) entfernt. Beschallt Lösungen wurden in PBS und plattiert (20 & mgr; l) in dreifacher Ausfertigung auf Sabouraud-Dextrose-Agar seriell verdünnt. Die Platten wurden bei 37 ° C unter aeroben Bedingungen für 48 h inkubiert. CFU wurden unter Verwendung eines Stereomikroskops gezählt, und die Ergebnisse sind in koloniebildenden Einheiten pro ml (CFU /ml)
Biofilm Architektur Analyse ausgedrückt. SEM
Specimens mit angebrachtem Biofilme wurden gespült mit sterilem PBS und platziert in 1% Osmiumtetroxid für 1 h. Die Proben wurden anschließend in gereinigtem Wasser, dehydriert in einer Reihe von Ethanolwaschschritten (70% für 10 min, 95% für 10 min, und 100% für 20 min) gewaschen und luftgetrocknet, in einem Exsikkator vor der Sputter-Beschichtung mit Gold [24, 25]. Als nächstes wurden Proben auf Aluminiumstummel montiert und mit Gold beschichtet. Die Biofilm Oberflächenmerkmale wurden bei 15 kV mit SEM (JSM 5600LV, JEOL, Tokyo, Japan) bei 1.500 × in einer Hochvakuum-Modus visualisiert
Analyse Biofilm-Architektur. CLSM
Biofilme auf PMMA-Oberflächen gebildet wurden gefärbt mit die Live /Dead BacLight Viability Kit, bestehend aus SYTO-9 und Propidiumiodid (PI). Bevor die CLSM Untersuchungen Proben wurden vor Licht geschützt und 20 min bei 37 ° C inkubiert [24, 25]. (- TCS SP5, Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland LEICA) Bilder von gefärbten Biofilme wurden unter Verwendung eines CLSM System erfasst. Eine Reihe von Bildern wurden für eine dreidimensionale Ansicht des Biofilms auf 1 & mgr; m-Abständen in der z Schnitt erhalten. Wenigstens fünf repräsentative optische Felder wurden für jede Probe untersucht.
Wurde COMSTAT Software verwendet, um CLSM-Bilder analysieren. Die Architektur Eigenschaften von COMSTAT analysiert Biofilme enthalten die Biovolumen (um 3 /& mgr; m 2), mittlere Dicke (um), und Rauhigkeitskoeffizient. Die statistische Analyse
Daten statistische Software analysiert wurden ( SAS v 9.0;. SAS Institute Inc., Cary, NC) mit einem Signifikanzniveau von 5% festgelegt. Die Annahmen der Gleichheit der Varianzen und Normalverteilung der Fehler wurden für jede Variable ausgewertet. Wenn die Normalität verletzt wurde, wurden die Daten logarithmisch transformiert. Faktoren in den Reaktionsvariablen zu stören (C. albicans
lebende Zellen, CFU /ml), Bio-Volumen (μm3 /μm2), mittlere Dicke (um) und Rauhigkeitskoeffizient) mit Zwei-Wege-ANOVA (Typ und Bewertung analysiert Periode). Post-hoc-Vergleiche wurden mit Tukey ehrlich signifikante Differenz (HSD) Test durchgeführt.
Ergebnisse
