Zusammenfassung
Hintergrund
Debridement und Desinfektion des Wurzelkanalsystems ist ein entscheidender Schritt in der endodontischen Verfahren. Die Wirksamkeit der Bewässerung stützt sich sowohl auf die mechanische Spülwirkung und die Fähigkeit von Spülungen Gewebe zu lösen und Bakterien zu töten. Das Ziel der vorliegenden Studie ist es, die Zytotoxizität von Qmix ™ Wurzelkanal Spüllösung auf immortalisierten humanen Knochenmark mesenchymale Stammzellen (hTERT-MSC-C1) zu bewerten und zu vergleichen, und zum Vergleich mit dem von Natriumhypochlorit (NaOCl).
Methoden
immortalisierten humanen Knochenmark mesenchymale Stammzellen (hTERT-MSCs) wurden Qmix ™ und NaOCl ausgesetzt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) und AlamarBlue Assays beurteilt. Die Zellmorphologie wurde nach zwei Stunden der Exposition gegenüber Qmix ™ und NaOCl sucht. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Untersuchungen wurden nach 2 und 4 Stunden Inkubationszeiten durchgeführt. Schließlich Ethidiumbromid /Acridin-Orange (EB /AO) wurde Fluoreszenzfarbstoff an die Zellen in den Schiebern 8-Kammer aufgebracht, nachdem sie mit den Testmitteln für 2 Stunden inkubiert wurden lebende und tote Zellen zu detektieren. Die Beobachtungen wurden tabellarisch dargestellt und statistisch ausgewertet.
Ergebnisse | Qmix ™ Exposition in einem signifikant höheren Prozentsatz der Lebensfähigkeit der Zellen als NaOCl im MTT und AlamarBlue Assays zu drei Zeitpunkten im Vergleich zur Kontrolle geführt. Die SEM-Analyse zeigte eine minimale morphologische Veränderungen mit Zellen assoziiert, die dem Qmix ™ Lösung ausgesetzt wurden, mit wenig Schrumpfung und Fragmentierung der Zellwand. Die lebend /tot-Analyse zeigte, dass die Zahl der lebenden Zellen nach der Exposition gegen Qmix ™ ähnlich war zu derjenigen der unbehandelten Kontrolle. Es konnte keine Zellstruktur mit der NaOCl-Gruppe beobachtet werden, Zell-Lyse anzeigt.
Schlussfolgerung
Sowohl menschlichen Knochenmark-MSCs die Qmix ™ und NaOCl Lösungen toxisch waren. Jede Lösung kann in einer anderen Weise induzierten Zelltod haben, wie in der Zellebensfähigkeit, SEM und Fluoreszenzstudien belegt. Je langsamer Zelltod durch Qmix ™ induziert daher möglicherweise weniger aggressiv und mehr akzeptabel zu lebenden Geweben.
Schlüsselwörter Zytotoxizität Natriumhypochlorit Qmix ™ mesenchymalen Stammzellen Wurzelkanal Spülungen elektronische ergänzendes Material
Die Online-Version dieses Artikels (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-27) enthält zusätzliches Material, das autorisierten Benutzern zur Verfügung
Hintergrund
der Erfolg der endodontischen Therapie hängt von der Ausrottung von Mikroben aus dem Wurzelkanal. System und die anschließende Prävention von Reinfektion. Wurzelkanalbewässerung hat eine Schlüsselrolle für den Erfolg der Endodontie. Während und nach der Instrumentierung, Spülungen erleichtern die Entfernung von Mikroorganismen, Gewebereste und Dentinspäne aus dem Wurzelkanal durch einen Spülmechanismus [1, 2].
Ein idealer Wurzelkanal Berieselungslösung sollte nicht toxisch sein, mit einem breites antimikrobielles Spektrum und die Fähigkeit, nekrotischen Pulpagewebe, Inaktivierung von Endotoxinen zu lösen, und entweder die Bildung einer Schmierschicht zu verhindern oder auflösen [3, 4]. Derzeit ist keine einzige Lösung, die diese Ziele erreichen können, und der kombinierte, gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Verwendung von zwei oder mehr Spüllösungen ist daher erforderlich [5]. Natriumhypochlorit (NaOCl) und Chlorhexidindigluconat (CHX) sind zwei gemeinsame antibakterielle Mittel als Wurzelkanal Spülungen verwendet [5-7].
Derzeit, Natriumhypochlorit (NaOCl) (0,5-6,15%) und EDTA (15-17% ) sind die beiden am häufigsten verwendeten intrakanalären Spülungen [5, 8]. Obwohl Natriumhypochlorit die meisten der wünschenswerten Eigenschaften hat, kann sie auch Zytotoxizität und schweren Entzündungsreaktionen erzeugen [9, 10]. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zur Entfernung der anorganischen Komponente der Schmierschicht wirksam ist [11].
Aufgrund unerwünschte Ergebnisse, eine Kombination dieser Spülungen ist nicht ratsam, [12-15]. Daher hat die sequentielle Verwendung von EDTA, CHX und NaOCl wurden von vielen Forschern befürwortet, um eine optimale Wurzelkanalspülung Ergebnissen [16-18]. Es ist zwingend notwendig, dass die Wurzelkanal Spülungen nicht den Heilungsprozess des Apikalbereich behindern darf. Die Biokompatibilität dieser Materialien ist wichtig, da sie mit den periradikulären Gewebe in Kontakt kommen.
Qmix ™ ist ein 2-in-1-Lösung mit einer Bisbiguanid antimikrobielle Mittel (2% CHX) und eine Polyaminocarbonsäure Calcium-Komplexbildner enthält, Mittel (17% EDTA) [19]. Qmix ™ wurde bei der Entfernung der Schmierschicht als wirksam erwiesen und hat auch wesentliche antimikrobielle Eigenschaften [19-22]. Allerdings sind die Daten, die Zytotoxizität dieses Mittels in Bezug auf nicht verfügbar sind. Daher wurde die vorliegende Studie durchgeführt, die Zytotoxizität der Qmix ™ Spüllösung auf immortalisierten humanen Knochenmark mesenchymale Stammzellen (hTERT-MSC-C1) unter Verwendung von Zelllebensfähigkeitstests, Zellmorphologie Auswertung und Fluoreszenzlichtmikroskopie zu bewerten und zu vergleichen; 5,2% NaOCl wurde zum Vergleich verwendet.
Methoden
Die Studie, die von der Abteilungs-Review Board of College of Dentistry Research Centre, König Saud University, Riad genehmigt wurde.
Testlösungen
Qmix ™ 2-in -1 (Dentsply Tulsa Dental, OK, USA) und 5,25% NaOCl (Clorox Co., Oakland, CA, USA) wurden in dieser Studie verwendet.
Stammzellen menschlichen Knochenmark mesenchymale Immortalized
Zellkultur (hTERT- MSC-C1), bei der 25
th Passage wurden für alle Versuche in dieser Studie verwendet. Das Protokoll von Simbula et al. [23] wurde in dieser Studie mit einigen Modifikationen verwendet. Die menschlichen Knochenmark mesenchymale Stammzellen wurden von Professor Moustapha Kassem am Odense University Hospital, Dänemark [24] zur Verfügung gestellt. Die kryokonservierten Zellen wurden rasch aufgetaut, überführt in einen T-75-Kolben (BD Falcon ™, NJ, USA) und in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (Gibco®), das mit Glutamin (Gibco®) ergänzt wurde, 1% Penicillin-Streptomycin (Gibco®), 10% fötales Rinderserum (FBS Gibco®) und 1% nicht-essentielle Aminosäuren (HyClone®), in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2/95% O 2 37 ° C. Bei 70% Konfluenz wurde das Medium abgesaugt, und die Zellen wurden mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen. Drei Milliliter vorgewärmtes 0,05% Trypsin /EDTA (Gibco®) wurde in den Kolben gegeben, und die Zellen wurden für 1 Minute inkubiert. Nach leichtem Klopfen, wurde Zellablösung unter einem umgekehrten Lichtmikroskop (Observer A1, Zeiss®, Göttingen, Deutschland) überprüft, und 12 ml Kulturmedium wurde dann in den Kolben gegeben, um die enzymatische Wirkung von Trypsin zu neutralisieren. Zur Zellzählung wurden zwei Proben (10 ul) wurden aus der Zellsuspension nach entsprechender Durchmischung entnommen. Die Proben wurden in den oberen und unteren Kammern eines Neubauer Zählkammer Zählkammer (Paul Marienfeld GmbH & amp; Co. KG, Lauda-Königshofen, Deutschland) gegeben und die Zellen wurden manuell unter einem umgekehrten Mikroskop (Vergrßerung 10X) gezählt. Die Zellen wurden auf verschiedenen Platten und Folien geimpft, wie unten diskutiert, für jeden Teil der Studie. Alle Verfahren wurden unter einer Klasse II Laminarströmungsabzug (LabGard ES 425 Biologische Sicherheitswerkbank, NuAire®) durchgeführt.
MTT Zelllebensfähigkeitstest
Zellen in 96-Well-Platten (klar, flachen Boden, Polystyrol TC- ausgesät behandelten Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen) in einer Konzentration von 1 × 10 4 Zellen /Vertiefung und wurden dann für 24 Stunden inkubiert, um die Zellhaftung an den Boden der Vertiefungen zu ermöglichen. Die Kulturmedien wurden dann von jedem abgesaugt und gut mit 150 ul sterilen Lösung (Qmix ™ oder NaOCl) ersetzt. Acht Brunnen verwendet wurden, wie für jede Gruppe repliziert
Jede Untergruppe für folgende Zeiträume inkubiert. 2, 4 oder 24 Stunden. Dann wurden 10 ul der MTT-Reagens (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA) wurde zu jeder Vertiefung zugegeben. Danach 96-Well-Platten wurden weiter bei 37 ° C für 3 Stunden inkubiert. Schließlich wurde die Lösung aus jeder Vertiefung abgesaugt und 150 ul lösenden Mittel zugegeben, um die Formazan-Niederschlag zu lösen. Die Extinktion jeder Probe wurde mit einem Mikroplattenleser (Epoch Mikroplatten-Spektralphotometer, BioTek®) bei einer Wellenlänge von 570 nm gemessen. Die Daten wurden unter Verwendung von Gen5 Datenanalyse-Software (BioTek®, USA) gesammelt. Das Experiment wurde zweimal in jedem Intervall für jede Gruppe wiederholt.
AlamarBlue (AB) Zelllebensfähigkeitstest
die gleichen Gruppen, die für den MTT-Assay verwendet wurden (siehe oben) für die AB-Test mit den gleichen Abständen verwendet wurden. Die Testmittel wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Nach 2-, 4- und 24-Stunden Inkubationszeiten, 10% AB-Reagenz (Serotec®, Oxford, UK) wurde in jede Vertiefung gegeben. Nachdem die Platten für weitere 4 Stunden inkubiert wurden, wurde die Fluoreszenz jeder Vertiefung bei Wellenlängen von 530/25 und 590/35 nm Anregung /Emission unter Verwendung eines Fluoreszenz-Lesegerät (BioTek®) gemessen. Die Daten wurden mit Hilfe der Gen5 Datenanalyse-Software (BioTek®, USA) gesammelt. Das Experiment wurde zweimal in jedem Intervall für jede Gruppe wiederholt.
Beurteilung Zellmorphologie
Zellmorphologie mit SEM nach 2 und 4 Stunden nach der Exposition gegenüber den Testlösungen wurde bewertet. Kurz gesagt, 8 x 10 4 Zellen gut /wurden auf Glasdeckgläser ausgesät (1 × 1,5 cm) in 6-Well-Platten (CELLSTAR®, Carrollton, TX) über Nacht. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit den Testlösungen ausgesetzt. Zwei Milliliter jeder sterile Spüllösung wurde auf die Objektträger in jede Vertiefung gegeben. Kontrolle unbehandelten Zellen wurden in Kulturmedium gehalten. Unmittelbar nachdem die Testlösungen zugegeben wurden, wurden die Zellen unter einem umgekehrten LM (10-fache Vergrößerung) untersucht. Am Ende der Inkubationszeiten (2 und 4 Stunden) wurden die Lösungen in jeder Vertiefung abgesaugt. Die Objektträger wurden mit PBS gewaschen und wurden dann mit 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Na-Cacodylat-Puffer (pH 7,2) bei Raumtemperatur fixiert. Danach wurden die Proben mit 0,1 M Natriumkakodylat-Puffer gewaschen (pH 7,2).
Nach der Fixierung wurden die Proben für 1 Stunde mit 1% Osmiumtetroxid behandelt. Dann wurden sie mit destilliertem Wasser gewaschen und entwässert abgestufter Ethylalkohol Verwendung in Konzentrationen von 50%, 70%, 80%, 90% (5 Minuten), 95% (zweimal, jeweils 15 Minuten) und schließlich 100% absolutem Alkohol (zweimal, jeweils 30 Minuten). Die Proben wurden mit einem kritischen Punkt Trockner mit CO getrocknet 2 (SADRI-PVT-3B). Die Objektträger wurden mit Doppelklebeband auf Kupfer stubs montiert und dann Gold in einer Dicke von 5-7 & mgr; m durch Sputtern beschichtet. Die Proben wurden dann beobachtet und mit einem JSM-6360 LV Rasterelektronenmikroskop photographiert.
Zwei Gutachter die Mikrophotographien bewertet. Die Zellmorphologie wurde nach den folgenden Kriterien beschrieben: die Form der Zelle (normal oder abnormal verglichen mit der Kontrolle), die Befestigung an dem Untergrund, die Befestigung an anderen Zellen, Integrität zytoplasmatischen Oberfläche Verlängerungen (blebs oder Mikrovilli) und Zellwand. Rundheit der Zellen, die Anwesenheit von Bläschen oder Ablösung der Zellen angegeben größeren Zellschädigung [25, 26].
Live /Dead-Analyse
Zwei Lösungen für die Live /Dead-Analyse ausgewählt wurden. Ein modifiziertes Eagle-Medium (MEM) ohne Phenolrot (Gibco®, Gaithersburg, MD) wurde für dieses Experiment verwendet. Kurz gesagt, wurden in drei 8-chamber slides (Lab-Tek ®) bei einer Konzentration von 1,5 × 10 4 Zellen /Vertiefung und wurden dann inkubiert für 24 hrs Zelladhäsion ausgesäten Zellen stattfinden zu lassen. Das Kulturmedium in jeder Vertiefung wurde mit 300 & mgr; l jeder Lösung ersetzt und dann für 2 Stunden inkubiert. Schließlich wurde zu jeder Kammer 10 ul EB /AO Fluoreszenzfarbstoff zugegeben, und die Fluoreszenz der Zellen wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop analysiert invertierte (ECLIPSE Ti, Nikon, Tokio, Japan) mit 10-facher Vergrößerung. Die Bilder wurden mit Imaging-Software (NIS-Elements, Nikon, Tokio, Japan) eingefangen. Die EB /AO fluoreszierender Farbstoff wurde durch Vermischen von 15 mg Acridinorange mit 50 mg Ethidiumbromid Pulver hergestellt, die zuerst in 1 ml 95% Ethanol gelöst und dann in 49 ml destilliertem Wasser (dH 2 O) verdünnt.
die Bilder wurden von zwei Gutachtern bewertet nach vorher beschriebenen Kriterien. Unter der Grünfilter, eine intakte grüne Kern, der mit dem Steuer vergleichbar ist, zeigt eine tragfähige Zelle, während eine grüne fragmentierten Kern frühen Apoptose anzeigt. Ein roter Kern zeigt eine zerbrochene Zellwand, während ein roter intakten Kern Nekrose zeigt, und eine fragmentierte roten Kern zeigt späte Apoptose unter dem roten Filter [27, 28].
Daten und statistische Analysen
Die Ergebnisse des MTT und AlamarBlue-Assays wurden als Prozentsätze im Vergleich zur Kontrolle (100% = keine Toxizität) berechnet. Die Daten wurden mit SPSS Pc + Version 21.0 Statistik-Software analysiert. Beschreibende Statistik (Mittelwert und Standardabweichung) wurden verwendet, kontinuierliche Ergebnisvariablen zu beschreiben. Student t
-Test für unabhängige Proben wurde verwendet, um die Mittelwerte von zwei Gruppen zu vergleichen. Eine Einwegvarianzanalyse, durch einen Mehrfachvergleich nach Tukey-Test folgte, wurde verwendet, um die Mittelwerte der drei Gruppen zu vergleichen. Ein p-Wert von & lt; = 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet.
Ergebnisse | MTT-Test
Der MTT-Test wurde an drei Gruppen (die Qmix ™ Gruppe, NaOCl-Gruppe und Kontrollgruppe) durchgeführt, mit kultivierten hTERT-MSCs in 96-Well-Platten . Jede Gruppe wurde für 2, 4 und 24 Stunden inkubiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen für jede Gruppe wird als Prozentsatz der Kontrollgruppe zu jedem Zeitpunkt dargestellt. Der Prozentsatz der Lebensfähigkeit der Zellen jeder Lösung in Abbildung 1 veranschaulicht ist, wenn die Zellen 2, 4 und 24 Stunden Lösungen ausgesetzt waren, verringerte die Lebensfähigkeit der Zellen mit der Zeit. Die Lebensfähigkeit der Zellen ausgesetzt NaOCl war signifikant niedriger als die der zu Qmix ™ auf allen Zeitintervallen (P & lt; 0,05) exponierten Zellen. Abbildung 1 Der Prozentsatz der Lebensfähigkeit der Zellen für NaOCl und Qmix Lösungen bei 2, 4 und 24 Stunden nach der Exposition unter Verwendung von MTT-Test.
AlamarBlue Assay
Der AB-Assay wurde für die Qmix ™, NaOCl und Kontrollgruppen unter Verwendung von kultivierten hTERT-MSCs in 96-Well-Platten durchgeführt. Die Lebensfähigkeit der Zellen für jede Gruppe wird als Prozentsatz der Kontrollgruppe dargestellt. Die Lebensfähigkeit der Zellen Prozentsatz jeder Lösung in Abbildung 2 veranschaulicht ist, wenn die Zellen für 2 oder 4 Stunden inkubiert wurden, war die Zelllebensfähigkeit der NaOCl-Gruppe signifikant geringer als die der Qmix ™ Gruppe (P & lt; 0,05). Abbildung 2 Die Zellebensfähigkeit sowohl NaOCl und Qmix ™ Lösungen mit alamarBlue-Assay bei 2, 4 und 24 Stunden nach Exposition.
Zellmorphologie
Unbehandelte negativen Kontrollzellen zeigten variable Formen, einschließlich Rhomboid, dreieckig, oval und Spindel Formen, wie durch Lichtmikroskopie LM dargestellt (Figur 3) wurden die Zellen miteinander und mit dem Substrat verbunden. Die Zellwand erschien glatt und intakt, mit einigen Mikrovilli und Oberflächenerweiterungen. Gemäß der LM Untersuchung wurde die toxische Wirkung der Testlösungen evident unmittelbar nach ihrer Aufbringung auf die kultivierten Knochenmark-MSCs Mensch, und die normale Zellmorphologie wurde abgeändert unterschiedlich in jeder Gruppe (3). Eine hohe Konzentration (0,5 mg /ml) von NaOCl verursacht die Vakuolisierung des Zytoplasmas (3B), wohingegen Qmix ™ bei der gleichen Konzentration wenige Veränderungen in der Zellwand hergestellt und ohne Vakuolenbildung (3C). Abbildung 3 Human Knochenmark hTERT-MSCs unter invertiert LM Nach der Testmittel Zugabe (X10). A- Unbehandelte Zellen, B - Zellen ausgesetzt (0,5) Qmix ™ -Lösung (die Zellform wurde mit wenigen Änderungen beibehalten), C- Zellen ausgesetzt (0,5) NaOCl; Vakuolisierung war offensichtlich im Zytoplasma.
Gemß der SEM-Analyse nahm die Zellzahl im Vergleich zur Kontrolle nach einer 2-stündigen Exposition gegenüber 0,5 mg /ml NaOCl. Die verbleibenden Zellen waren kleiner, mit einem fadenförmigen oder runden Form (Abbildung 4). Zellen wurden aus dem Untergrund abgelöst und Zell-zu-Zell-Anhänge verloren. Lysosomale Sekrete aus der Zelle austretenden wurden beobachtet, und der Kern wurde durch die aufgebrochenen Zellwand extrudiert. Abbildung 4 Human Knochenmark hTERT-MSCs für 2 Stunden auf Qmix und NaOCl ausgesetzt. A - Qmix ™ (x100), B - Qmix ™ (x1000), C - NaOCl (x100, beachten Sie die runden oder fadenförmige Form der Rest-Zellen), D- NaOCl (x1000, die geplatzten Zellwand und der extrudierte Kern ).
nach einer 2-stündigen Exposition gegenüber Qmix ™, Form der Zellzahl und Zell waren denen der Kontroll ähnlich, mit Ausnahme der Anwesenheit eines schlecht definierten Zellkontur. Jedoch wurden die Zellen noch an benachbarte Zellen angebracht und an dem Substrat (Abbildung 4). In einigen Bereichen wurden Reste von Zellprozessen beobachtet. Der Haupt dramatische Änderung in der Zellmorphologie wurde in der Zellwand, die eine maschenartige Aussehen (4B) hatten, was darauf hinweist Desintegration. Nach 4 Stunden war die Veränderung der Zellmorphologie signifikanteren: die netzartige Aussehen der Zellen wurde intensiver, mit einem schlecht definierten Form und ein Verblassen Kontur und aufgebrochener Zellen-zu-Zell-Anhänge wurden beobachtet. Jedoch wurde die Bindung an das Substrat durch einige Zellen (Figur 5) gehalten wird. Abbildung 5 Human Knochenmark hTERT-MSCs für 4 Stunden zu Qmix ™ und NaOCl ausgesetzt. A- Qmix ™ (x100), B-Qmix ™ (x1000), C - NaOCl (x100), D- NaOCl (x1000)
Live /Dead-Analyse mit EB /AO-Färbung
Kultivierte humane hTERT Knochenmark. -MSCs wurden für 2 Stunden auf 0,5 mg /ml Qmix ™ und NaOCl ausgesetzt. Die EB /AO-Färbung wurde an die Zellen angelegt, die dann unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop untersucht wurden. Die Bilder für jede Gruppe angezeigt werden lebende Zellen in grün und tote Zellen rot. Die unbehandelten Zellen war intakt, wohldefinierte Kerne, die unter dem Grünfilter grün waren, wie in 6A gezeigt. Unter dem Rotfilter, zeigte nur die Zelloberfläche rote Fluoreszenz, nicht in den Zellkern, die eine intakte Zellwand (6B) angedeutet ist. Wenn die Zellen zu Qmix ™ ausgesetzt wurden, betrug die Zellzahl ähnlich der der Kontrollgruppe, und die Kerne waren grün, was zu dem Auftreten der Steuerzellen ähnlich war. Der einzige Unterschied war, dass einige dieser Zellen kondensiertes Chromatin hatte, die unter dem Rotfilter (6C, D) evident war. Wenn die Zellen zu NaOCl ausgesetzt waren, keine Zellstrukturen, wie beispielsweise der Kern oder Zellmembran, wurden beobachtet; Zell-Lyse war offensichtlich, und das Restmaterial war positiv sowohl für grüne und rote Fluoreszenz (6E, F). Abbildung 6 Live /Dead-Analyse menschlichen Knochenmark hTERT-MSCs unter einem Fluoreszenzmikroskop (X10). 6A, 6B - Unbehandelte Zellen mit dem Grünfilter, wird der Kern intakt, was eine lebensfähige Zelle anzeigt. 6B-mit dem Rotfilter, erschien der Kern dunkel, und nur die äußere Oberfläche der Zellen war rot, was darauf hinweist, dass die Zellwand intakt ist. 6C, 6D- behandelt mit Qmix ™ unter einem Fluoreszenzmikroskop (X10), 6E, 6F- mit NaOCl unter einem Fluoreszenzmikroskop behandelt (X10).
Diskussion
Dieser in vitro
Studie wurde durchgeführt, die zur Beurteilung Zytotoxizität der Qmix ™ Spüllösung auf menschlichen Knochenmark-MSCs. MSCs wurden als ein gutes Modell für die toxikologische Prüfung vorgeschlagen [29]. Die MSCs, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden durch die ektopische Expression von menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase (TERT h-) immortalisiert, was die Lebensdauer der Zellen erhöht [24] und behielten ihre stielartigen Eigenschaften [30]. Frühere Studien haben berichtet, dass sich unbegrenzt vermehrenden Zellen können für Dentalmaterialien [31] als Testmodell verwendet werden.
Die Beobachtungen aus der Studie zeigten, dass beide Lösungen (Qmix ™ und NaOCl) zu MSCs menschlichen Knochenmark toxisch sind und Zellschäden verursachen . Dies steht im Einklang mit den Ergebnissen früherer Studien, die auf NaOCl Toxizität berichtet [23, 32, 33]. NaOCl Toxizität kann seinen hohen pH (Hydroxylion Wirkung) zurückgeführt werden, die mit zytoplasmatischen Membranintegrität beeinträchtigt [34]. Darüber hinaus sind unsere Ergebnisse in Übereinstimmung mit denen einer vorherigen in vivo
Studie, die festgestellt, dass Qmix ™ ist giftig und kann eine Entzündungsreaktion [35] zu induzieren. CHX ist ein toxisches Mittel, das an die Plasmamembran der Zelle bindet und erhöht seine Durchlässigkeit, die Leckage von lysosomalen Enzymen ermöglicht [36]. EDTA, die die zweite Qmix ™ Komponente ist, ist auch zytotoxisch sein bekannt, vielleicht aufgrund seiner chelatisierenden Wirkung und der akzentuierte pH-Abfall, der es verursacht [11].
Lebensfähigkeit der Zellen wesentlich verringert, wenn die Zellen ausgesetzt waren NaOCl für alle Zeiträume untersucht. Die Lebensfähigkeit der Zellen deutlich verringert nach 2 oder 4 Stunden nach der Qmix ™ Lösung ausgesetzt wird. Darüber hinaus wurde nach 24 Stunden wurde die Lebensfähigkeit der Zellen deutlich verringert im Vergleich zu 2 und 4 Stunden Exposition. Diese Ergebnisse zeigen, dass die toxische Wirkung eines Mittels nach und nach mit der Zeit zunimmt. Diese Beobachtung ist in Übereinstimmung mit denen früherer Studien, dass die Toxizität der Bestätigung ist zeitabhängig [37]. Im Gegensatz dazu zeigten die MTT Assay-Ergebnisse eine signifikante Abnahme in der Zelllebensfähigkeit von Zellen, die zu allen Zeitperioden untersucht NaOCl ausgesetzt waren. Verglichen mit Qmix ™ -exposed Zellen verringerte Lebensfähigkeit NaOCl bei 2 und 4 Stunden.
Frühere Studien haben berichtet, daß der AB-Assay etwas empfindlicher als der MTT-Assay ist. Allerdings verlassen sich beide Assays auf enzymatischen Metabolismus, der oder durch die Testmittel induziert gehemmt werden kann, so dass eine falsch-positive oder falsch-negative Ergebnis. Daher ist eine sorgfältige Interpretation der Ergebnisse immer empfohlen [38]. Unsere Beobachtungen legen nahe, daß der AB-Test eine bessere Wahl für die Lebensfähigkeit der Zellen-Test ist, weil es leicht durchzuführen ist, konsistenter ist als der MTT-Assay und durch frühere Studien empfohlen [38, 39]. Es wird jedoch immer mehr als ein Test empfohlen verwenden Cytotoxizität zu bewerten. Daher frühere Studien, die ausschließlich auf dem MTT-Test verlassen sollte mit Vorsicht neu bewertet und interpretiert werden.
Mikroskopische morphologische Untersuchungen notwendig sind zelluläre Toxizität zu bestätigen [40]. Dies ist, weil eine Zelle toxische Veränderungen unterzogen werden kann, wie beispielsweise Ablösung, während noch MTT zu metabolisieren Fortsetzung zu Formazan in einer Überschätzung der Lebensfähigkeit der Zellen in dem MTT-Assay, verglichen mit der AB-Assay resultierende [38]. Daher wurden zellulären morphologischen Eigenschaften für beide Lösungen untersucht.
Zellen, die Qmix ™ ausgesetzt waren weniger morphologische Veränderungen angezeigt. Diese Beobachtung ist in Übereinstimmung mit Faria et al., Die berichteten, dass höhere Konzentrationen von CHX würde die Form der L929-Zellen [41] aufgrund seiner Zellfixierung Effekt [42] zu bewahren., Die REM-Aufnahmen für die Qmix ™ Gruppe Zytoplasma-Schrumpfung zeigte mit teilweise fragmentierte, aber intakte Zellwände. Diese Eigenschaften sind typisch für Apoptose, wie früher berichtet [40]. Darüber hinaus zeigte die EB /AO-Färbung hellgrünen fragmentierte Kerne, was darauf hinweist frühen Apoptose [27]. Die Zellen zu NaOCl ausgesetzt hatte Cytoplasma-Schrumpfung oder gerissenen Membranen, die typischen Merkmale der Nekrose sind [43]. Die EB /AO Anfärbung der NaOCl Gruppe angezeigt rot und grün, reflektierenden Restmaterial, das das Ergebnis der Zelllyse sein kann, und keine Zellstruktur beobachtet werden konnte. Die Gesamt Analyse dieser Ergebnisse zeigt, dass die Zellen in den Qmix ™ Gruppen in den frühen Stadien der Apoptose sind, aber noch nicht tot ist, im Gegensatz zu der NaOCl-Gruppe. Sowohl NaOCl und Qmix ™ sind zytotoxische; jedoch scheint es, dass ihre Art der Zellabtötung infolge ihrer unterschiedlichen Zusammensetzungen unterscheidet. Gemäß Galluzzi et al. Apoptose (Typ 1), autophagy (Typ 2), Nekrose (Onkose, Type 3), und mitotische Katastrophe: [44] können Zelltod in vier verschiedene Arten auf die morphologischen Eigenschaften der absterbenden Zellen basiert klassifiziert werden. Jeder Modus des Zelltods hat seine eigene Funktion; Nekrose induziert eine Entzündungsreaktion, wenn es benötigt wird, während apoptotische Zellen in vivo
schnell ohne Induzieren einer Entzündungsreaktion phagozytiert werden, die einen Mechanismus zur Vermeidung einer Immunaktivierung betrachtet wird. Nach unseren Erkenntnissen, könnte diese Art des Zelltods mit einer hohen Konzentration der Exposition gegenüber NaOCl zugeordnet werden.
Apoptosis eine aktive Form des Zelltods als programmierter Zelltod bekannt ist, und es wird durch Zellschrumpfung und der Kern Chromatinkondensation gekennzeichnet gefolgt von Kernfragmentierung, mit der normalen morphologischen Erscheinung von cytoplasmatischen Organellen und der Aufrechterhaltung einer intakten Plasmamembran [44]. Nach unseren Erkenntnissen, diese Art der Zelltod könnte mit Qmix ™ Exposition in Verbindung gebracht werden. Jedoch weitere Marker, wie Nachweis von Caspasen, gespalten Substrate, Regler und Inhibitoren sind notwendig, diese Art von Zelltod zu untermauern mit Qmix ™ spekuliert [45]. Zelltod durch Apoptose bekannt ist, durch zwei Primärwege auftreten: einen extrinsischen Weg, die Todesrezeptoren umfasst, und einen intrinsischen Weg, der von den Mitgliedern der Bcl-2-Familie moduliert wird [46], die der äußeren mitochondrialen Membrankomponenten besteht [47] . Daher werden Mitochondrien Schlüsselorganellen in den Pfaden betrachtet Tod zusätzlich zu seiner normalen Stoffwechselaktivität der Zelle [48, 49]. Jedoch können diese Proteine funktionieren auch in einigen normalen Stoffwechselwege. Somit mitochondrialen Stoffwechselaktivität Untersuchungen, wie der MTT-Assay, müssen diese möglichen Überlappungen zwischen pre-apoptotischen Zellaktivität und normalen Zellstoffwechsels [40] betrachten. Diese Überlappung könnte die widersprüchlichen Ergebnisse der AB und MTT-Assays erklären.
In-vitro-Zytotoxizität
Untersuchungen berichtet, dass CHX eine höhere Toxizität in Zellkulturen als NaOCl hatte [33, 41]. Doch in vivo
Studien legen nahe, dass CHX oder Qmix ™ ist weniger aggressiv als NaOCl [35, 50]. Dieser Unterschied könnte zurückzuführen Abwehrmechanismen zu bewirten, die in der in-vivo-
Umgebung arbeiten
Unsere in vitro
Studie gelten die folgenden Einschränkungen:. Es wurde an kultivierten Zellen durchgeführt, und die Ergebnisse repräsentieren nur die Reaktion von diese Zellen isoliert, ohne Berücksichtigung der Abwehrmechanismus des Wirts zur Entgiftung. Weiterhin ist in einer klinischen Umgebung, werden die Lösungen immer Wurzelkanäle geliefert, die von Dentin umgeben sind, und werden dann an den periapikalen Bereich extrudiert. Frühere Studien haben berichtet, dass die zytotoxische Wirkung von Spülungen von Dentin neutralisiert werden kann [33, 51]. Wir stellten die Lösungen direkt auf die Zellen, und es werden keine Versuche unternommen wurden, diese Lösungen durch Wurzelkanäle zu liefern, die klinische Szenario zu imitieren.
Schlussfolgerungen
Innerhalb der Grenzen dieser Studie kann gefolgert werden, dass sowohl die NaOCl und Qmix ™ -Lösungen sind giftig für die menschliche MSCs Knochenmark. Die Qmix ™ Lösung, die langsame Zelltod induziert, scheint biokompatibler als die NaOCl Lösung. Daher auf der Grundlage dieser Beobachtungen kann gefolgert werden, dass die Qmix ™ ist ein relativ sicherer Wurzelkanal Berieselungs zu NaOCl verglichen wird.
Erklärungen
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die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Beiträge der Autoren
AK, SMA, AM und MAE die Studie, Laborverfahren durchgeführt und die Bewertung der Ergebnisse. SA, AK und in der Entwicklung des Konzepts, Design der Studie, Überarbeitung des Manuskripts und die statistische Analyse einbezogen AMA. Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.
