Zusammenfassung
Hintergrund
Es gibt Verwirrung über die Definition des Begriffs "Lebensfähigkeit Zustand (s)" von Mikroorganismen. "Viability-Färbung" oder "Vitalfärbung Techniken" werden verwendet, um lebende von toten Bakterien zu unterscheiden. Diese Färbungen, zunächst auf planktonischen Bakterien festgestellt, kann schwerwiegende Mängel aufweisen, wenn sie für mehrere Arten von Biofilmen angewendet. Die Ergebnisse der Färbetechniken sollten mit entsprechenden mikrobiologischen Daten verglichen werden.
Diskussion
Viele Begriffe "Vitalität Zustände" von Mikroorganismen zu beschreiben, aber einige von ihnen sind irreführend. Autoren definieren "lebensfähig", wie "in der Lage zu wachsen". Dementsprechend Färbemethoden substituierbar sind, da keine Färbung Lebensfähigkeit nachweisen kann
Die Zuverlässigkeit einer kommerziellen "Lebensfähigkeit" Anfärben Assay (Molecular Probes) wird diskutiert, auf der Grundlage der entsprechenden Produktinformationsblatt:. (I) Färbung Prinzip; (II) Die Konzentrationen von Bakterien;.
(III) Berechnung der Live /Dead-Anteile in vitro
Ergebnisse der "Lebensfähigkeit" Kit sind abhängig von der Konzentration 'Flecken und auf ihr Verhältnis zu der Anzahl der Bakterien in der Test. Im Allgemeinen wird diese Färbesystem ist für Multispezies Biofilme nicht geeignet, so dass falsche Aussagen sind von den Nutzern dieser Technik veröffentlicht.
Um die Ergebnisse der Färbung mit bakteriellen Parameter geeignete Techniken ausgewählt werden sollte vergleichen. Die Beurteilung der Colony Forming Units unzureichend ist, sondern die Berechnung der Plattierungseffizienz notwendig ist. Vital Fluoreszenzfärbung mit Fluoreszeindiacetat und Ethidiumbromid scheint die beste bewährte und geeignete Verfahren in der Biofilmforschung.
Im Hinblick auf die Mutagenität der Färbung Komponenten Benutzer sollten sich bewusst sein, dass nicht nur Ethidiumbromid schädlich sein könnten, sondern auch eine Vielzahl anderer Stoffe, aus denen die Toxizität und Mutagenität nicht berichtet
Zusammenfassung
. - die Nomenklatur "Lebensfähigkeit" und "Vitalität" in Bezug sollte mit Bedacht eingesetzt werden
-. das Handbuch der kommerziellen "Lebensfähigkeit" Kit selbst weist darauf hin, dass der Kit nicht geeignet für natürliche Multispezies Biofilmforschung ist, wie durch eine Reihe von Literatur unterstützt
-. die Ergebnisse mit verschiedenen Flecken erhalten werden durch die Beziehung zwischen Bakterienzahl und der Menge an flecken im Test verwendeten beeinflusst. Entsprechende Vitalität Daten sind anfällig für künstliche Verschiebung
-. Als mikrobiologische Parameter der Platierungseffizienz sollten zum Vergleich herangezogen werden
-. Ethidiumbromid mutagen ist. Die Forscher sollten sich bewusst sein, dass alternative Färbung Verbindungen auch oder sogar mutagen sein kann.
Schlüsselwörter Zahnbelag Biofilm Mikroorganismen Viability Zustand Vital Fluoreszenz bakterielle Lebensfähigkeit Kit Mutagenität Hintergrund
Die Definition der sogenannten "Lebensfähigkeit Zustand ( s) "von Mikroorganismen ist eine Frage der Verwirrung und Diskussion seit Jahrzehnten (für einen Einblick in die Fülle der Literatur siehe [1-5]). Vor kurzem wurden zwei Manuskripte diskutiert dieses Thema. Hannig et al. [6] untersuchten den Einfluss eines neuartigen Mundwasser Hydroxyapatit Mikro-Cluster auf Bakterienadhärenz mit dem BacLight ™ unter Verwendung von Live /Dead-Färbetechnik. Tawakoli et al. [7] verglichen verschiedene Live /Dead-Färbungen "zum Nachweis und zur Quantifizierung von adhärenten Mikroorganismen"
in der anfänglichen oralen Biofilm. Im Einklang mit früheren Literatur diese beiden Artikel zeigen, dass ernsthafte Versuche haben in den vergangenen Jahrzehnten gemacht worden, um die verschiedenen Zustände zwischen tot und leben (Meeres- und oral) Mikroorganismen, und dass "die Lebensfähigkeit Färbung" oder "Vitalfärbung Techniken" zu definieren, wurden und werden immer noch als ein Versuch, die in Biofilmen das Problem der Unterscheidung zwischen lebenden und toten Mikroorganismen zu überwinden. in den letzten Jahren
immer mehr Wissenschaftler in der dentalen Biofilm-Forschung mit im Handel erhältlichen Vitalität /Lebensfähigkeit Flecken vertraut geworden sind, vor allem die BacLight Assay ( BLA; BacLight ™ Live /dead-Färbetechnik). Allerdings hat diese Färbung Prinzip schwere Mängel, wenn sie nicht definiert natürliche Multispezies Biofilmproben angewendet. Ergebnisse dieser und anderer Färbetechniken sollte klassische mikrobiologische Techniken wie die Beurteilung der koloniebildenden Einheiten (CFU) und zuverlässiger, die Berechnung von bakteriellen Plattierungseffizienz (PE) verglichen werden. Diese Vergleiche mit einem "Goldstandard" sind sehr selten, wenn kommerzielle Kits in Biofilm-Forschung verwendet werden. Des Weiteren Komponenten dieser lebenswichtigen Flecken möglicherweise mutagen sein kann.
Zusammengefasst der Zweck dieses Manuskript ist die Grundlage, Nutzen und das Risiko einer "lebensfähig" und "vital" Flecken vor allem in Biofilm-Forschung zu diskutieren, mit besonderer Aufmerksamkeit dem natürlichen Zahn Biofilmen und Vitalfluoreszenzfärbung mit Fluoreszeindiacetat /Ethidiumbromid [8]. Aus wissenschaftlicher Sicht ist es wichtig, dass aus einer solchen Färbetechniken abgeleiteten Daten korrekt den bakteriellen Status widerspiegeln.
Diskussion
Was die Wurzel des Problems ist?
Aus ganzheitlicher Sicht ist die Debatte umfasst verschiedene Ebenen. Erstens stellt die Diskriminierung von tot oder lebendig Mikroorganismen ein entscheidendes Problem in (Umwelt-) Bakteriologie. Das grundlegende Problem ist seit Jahrzehnten existiert und noch nicht gelöst worden. In diesem Zusammenhang werden häufig die Begriffe "Vitalität" und "Lebensfähigkeit" verwendet, und sehr oft gemischt - einige Forscher diese Bedingungen vollständig austauschen [9]
Zweitens "vital Flecken" sind Surrogate der Regel nur, sondern sind schnell und einfach. in Studien Geräte untersuchen, beispielsweise die antibakterielle Wirkung von Substanzen. Hier ist das Problem ist die große Vielfalt der Färbung Substanzen und damit der Färbung Prinzipien, so dass die "Fülle von Möglichkeiten ergänzt Verwirrung"
[10].
Ähnlich Pamp et al. [11] heißt es: "In jüngerer Zeit entwickelte Flecken, wie die Syto Flecken .... effizient Zellen in nahezu jeder Farbe des Regenbogens "Fleck
Das mag witzig klingen -. sondern spiegelt lediglich das Problem. Wie gerade erwähnt, Tawakoli et al. [7] verwendet Kombinationen von mehreren Flecken (beispielsweise FDA, CFDA, TCFDA, EB, sowie SYTO 9 /PI, Sytox rot, außer Calcein AM). Davey [10] bezieht sich auch auf FDA, PI und SYTO 9, sondern darüber hinaus auf Substanzen wie SYTO Grün I, DiBAC4, Pyronin Y, Rhodamin 123 und Thiazol Orange. Es ist kein Wunder, dass dieser Autor [10] weitere vier Bewertungen beziehen sich nur über den "modus operandi"
der verschiedenen fluoreszierenden Flecken und die "große Vielfalt an Möglichkeiten in Bezug auf Flecken Auswahl, Konzentration, Färbezeit zu informieren, etc ".
Wenn eine weitere Analyse, wird das Problem noch komplexer. Einige Autoren kritisieren die begrenzte Verwendung von Propidiumiodid (PI) als die Lebensfähigkeit der Zellen (sic!)
Indikator [12, 13], während andere überwachte auffallende Unterschiede zwischen SYTO 9 und SYTO 12 in Bezug auf den Einfluss der Porine auf die Aufnahme Kinetik Diese Farbstoffe [14]. Dies bedeutet, dass, wenn antibakterielle Substanzen, die Zellmembran Integrität zu stören die Verwendung dieser Vitalfärbungstechniken bewertet werden kann irreführend sein. Ein inhärenter Aspekt dieses Problems, nämlich die Eignung von Färbeverfahren, ist die Abhängigkeit von der Konzentration "Flecken der Ergebnisse (siehe unten).
Drittens, die Benutzer sind zum größten Teil leider nicht bewusst, dass eine solche" verführerisch "-Tests wurden nur für eine sehr begrenzte Anzahl von Bakterienarten validiert [13, 15]. Von 15 000 "Hits" (250 Bewertungen) erzeugt in PubMed, indem er für "Durchflusszytometrie & amp; Bakterien ", nur drei wurden nach der Filtration der Datenbank links bei der Verwendung von" Biofilm "als zusätzliches Tracing Begriff. Keiner dieser drei Artikel trägt zur Debatte.
Entscheidend ist, dass "Lebens Flecken" und, viel wichtiger, ihre Kombinationen zu herkömmlichen bakteriologischen Daten direkt verglichen werden. Wie später im Detail diskutiert kann dies nicht die Beurteilung der CFU, aber von PE. In der Zahnmedizin hat einige entsprechende Arbeiten abgeschlossen worden einzelne oder eine klare Zahl der Arten in vitro unter Verwendung
ohne bakteriologische Untersuchungen Durchführung [6, 16-18], während einige Unternehmen diese Färbemethode verwendet vertrauensvoll per se
in seiner Zuverlässigkeit [ ,,,0],19, 20]. Wenn die SYTO 9 /PI Kombination in der Tat zu den entsprechenden mikrobiologischen Einschätzungen im Zusammenhang wurde, war das Ergebnis im Widerspruch [21-23]. Unserer Meinung nach ist es unmöglich, Studien, um herauszufinden, wo besondere Beispiele für diese wichtigen Flecken und ihre Kombinationen richtig verglichen wurden und auf mikrobiologische Daten im Zusammenhang mit Biofilmen wie Zahnbelag über natürliche Multispezies.
Schließlich können die Farbstoffe oder sind toxisch oder mutagen . In Bezug auf die Liste der Verbindungen, wie bereits erwähnt und exzerpiert aus [7] und [10], ist zu prüfen, ob ein Schaden oder ein Risiko bei der Verwendung dieser Stoffe.
Viability gegen Vitalität
Netuschil [8] aufgezeichnet 49 Begriffe "Vitalität Zustände" von Mikroorganismen zu beschreiben (zB aktive Mikroben, kryptische Wachstum, direkte Lebensfähigkeits-Titer [DVC], progressive dormancy, vegetativen Ruhephase, Zwergzellen, moribund Zellen, nonculturability, nonplateable, Stase Überleben, reproduktive Lebensfähigkeit, lebensfähig, aber nicht kultivierbaren [VBNC], nicht lebensfähig, aber resuscitable, vital, viviform, etc.), wie in 34 verschiedenen entsprechenden Publikationen zitiert [1, 2, 4, 24-54] (siehe Tabelle 1). Während die Tabellenverweise von 1962 bis 1998 zeigt, ist die Debatte älter und war bereits relevant an der Wende des 19
th an die 20 Jahrhundert [55-60]. Ein Beispiel dafür ist die "Große Platte Graf Anomaly" [61, 62] siehe auch [63]. Schon damals wurden lebenswichtige Anfärbungen diskutiert als Versuch verwendet werden, um die Mängel der Kulturtechniken überwinden [64-68]. Es scheint, dass die Vergangenheit Diskussion [69] an der Wende des Jahrhunderts "neu belebt" wurde [41, 70-78]. Bemerkenswert ist, dass einige Begriffe verwenden (zB, ruhend, VBNC) sind auch relevant, wenn zu probiotischen Bakterien beziehen [79, 80] .Tabelle 1 Verwendete Begriffe "Vitalität Zustände" von Mikroorganismen zu beschreiben (aus [8])
Akklimatisierung [ ,,,0],30]
"Ruhende Zellen" [17]
Aktive Mikroben [20]
Resuscitation [3, 4, 15, 24, 28-31]
Alive "Lebendigkeit" [15]
"Shut down Zellen", "shut down Zustand" [17]
"Anabiotic (ruhende) Zustand "[15]
Somnicells [8, 11, 30]
" Taschen von Enzymen "[4, 12]
Starvation [10, 17, 29]
Cryptic Wachstum [24, 26, 27, 29]
- "Wahre Hunger" [15]
kultivierbaren, Kultivierbarkeit [4 , 10, 11, 31]
"Substrat beschleunigt den Tod", "Substrat
- Nonculturable, nonculturability [22, 24]
Accelerated Stress" [6 , 15, 26, 29, 31, 33]
Debilitation [9]
Überleben [5, 11, 20, 22, 29]
tot, Tod [3, 4, 9, 11, 15, 16, 20, 26], [29]
- "Survivability" [3]
- "Death Phase "[15, 29]
-" Stasis Überleben "[25]
" Die-off "[31]
führbare [3, 10, 15, 16, 18, 30, 31]
Direktlebendzellanzahl (DVC), DVC-Methode [3, 4, 10, 15, 18, 29-31, 34]
- nicht lebensfähig [3, 15, 16, 20]
Viability [3, 4, 6, 9, 12, 13, 15, 16], [19, 22, 23, 26, 29]
ruhend dormancy [11, 12, 15, 20, 23, 28-30, 32]
- "Scheinbare Lebensfähigkeit" [6, 15]
- "Progressive dormancy" [1, 30]
- "Reproductive Lebensfähigkeit" [23]
- "Vegetative dormancy" [15]
- "Wahre Lebensfähigkeit" [6]
Dwarf Zellen, inaktive Zwerge, ultramicrobacteria [6, 14, 15, 29, 32]
"Viable aber nonculturable" ( VBNC) [3, 4, 8, 10, 12, 15, 16, 21], [22]
Wachstumsarrest [25]
- VBNC Hypothese [2-4 , 7]
"Killer-Phänotyp" [15]
- VBNC Zustand [3, 4, 10, 22, 24, 29, 31, 33], [34] < Lysis br>
[20]
- "Lebensfähige aber nicht behebbare" [31]
Sterbende Zellen [29]
- "Non -viable aber resuscitable "[16]
'Nonplateable" [24]
- "kultivierbarer aber lebensfähig" [28]
Protisten Weiden [ ,,,0],11]
Vital, Vitalität [15, 16, 26]
"Pseudosenescent" [29]
Viviform [11, 30]
Referenzen:
1Barcina et al. 1989 [24]
18Kogure et al. 1979 [40]
2Barer et al. 1993 [25]
19Korber et al. 1996 [41]
3Bogosian et al. 1996 [26]
20Mason et al. 1986 [1]
4Bogosian et al. 1998 [27]
21McKay 1992 [42]
5Bowden & amp; Hamilton 1998 [28]
22 Morgan et al. 1993 [43]
6Button et al. 1993 [29]
23Nebe-von Caron et al. 1998 [44]
7Colwell 1993 [30]
24 Nilsson et al. 1991 [45]
8 Colwell et al. 1985 [31]
25Nyström 1995 [46]
9 Dawe & amp; Penrose 1978 [32]
26 Postgate 1977 [47]
10 Duncan et al. 1994 [33]
27 Postgate & amp; Hunter 1962 [48]
11 Gonzáles et al. 1992 [34]
28 Rose et al. 1990 [49]
12Gribbon & amp; Barer 1995 [35]
29Roszak & amp; Colwell 1987a [2]
13Höfle 1983 [36]
30 Roszak & amp; Colwell 1987b [50]
14 Hood et al. 1987 [37]
31 Roszak et al. 1984 [51]
15Kaprelyants et al. 1993 [4]
32Stevenson 1978 [52]
16Kell et al. 1991 [38]
33 Whitesides & amp; Oliver 1997 [53]
17Koch 1996 [39]
34 Wilson & amp; Lindow 1992 [54]
Leider haben einige der Begriffe gefunden und verwendet in Publikationen sind falsch, irreführend oder sogar paradox, vor allem die oft verwendete Begriff "lebensfähig, aber nicht kultivierbaren (VBNC)", das verwischt die Linie zwischen Vitalität und Lebensfähigkeit. Um Verwechslungen zu vermeiden, so viel wie möglich wir Kaprelyants et al beziehen. [4]: "Mehrere Klassifikationen der physiologischen Zustände von Mikroorganismen vorgestellt wurden. Wir haben zuvor vorgeschlagen
[3], dass alle Zelltypen betrachtet konnten drei Gruppen reduziert werden, wie folgt: "lebensfähig" auf eine Zelle beziehen, die eine Kolonie auf einer Agarplatte bilden kann, "vital" zu beziehen sich auf eine, die so nach Reanimation nur tun kann, und "nicht lebensfähigen" auf eine Zelle beziehen, die nicht so unter allen getesteten Zustand tun können. Nach dieser Terminologie sind ruhende Zellen vital Glossar der verwendeten Begriffe beschreiben die drei wichtigsten physiologischen Zuständen hier definiert "(zitiert aus [3])
physiologischen Zustand .Tabelle 2 (siehe Tabelle 2) " >
Phänotyps
führbare
der Teilung fähig; wird auf einer Agar-Platte, die eine Kolonie bilden.
Vital oder ruhend
kann nicht zu teilen oder ohne einer vorhergehenden Reanimationsphase eine Kolonie auf einer Agarplatte zu bilden .
Nicht lebensfähige
Unfähig Division; nicht eine Kolonie auf einer Agarplatte unter allen geprüften Zustand bilden.
Wir 'Hunger' die Phrasen oder an die Umgebungsbedingungen zu beziehen "hungernde Zellen" unter denen Zellen werden inkubiert, anstatt auf einen physiologischen Zustand. So verhungert Zellen (oder Zellen, die andere Spannungen gelitten haben) kann oder nicht ruhend sein. Trotz historischer Nutzung dieser Begriffe die Ausdrücke "direkte lebensfähige Zahl" und "tragfähige-but-nicht-kultivierbaren" sind unzutreffend, da solche Zellen nicht lebensfähig, wie oben definiert.
Gemäß [4] wir definieren "tragfähige" streng als "in der Lage zu wachsen". In dieser Hinsicht alle anderen Tests, zum Beispiel Zugversuche (DVC; [50]) oder Färbeverfahren, sind lediglich Proxies, da keine Art der Färbung Lebensfähigkeit nachweisen kann. So ist der Begriff "Lebensfähigkeit Fleck" eine falsche Bezeichnung per definitionem
und diese Flecken richtig benannt werden sollte, "vital Flecken". Leider ist die falsche Bezeichnung häufig von Invitrogen Ltd. (BacLight ™) verwendet und ist daher - aber falsch - von den Nutzern dieser Vitalität Tests angenommen
Die BacLight ™ Lebensfähigkeit der Bakterien-Kit (BacLight Assay, BLA)
. nach Angaben des Herstellers [81] BLA besteht aus zwei Flecken, Propidiumiodid (PI) und SYTO 9, die beide Fleck Nukleinsäuren. SYTO9 ist eine grün fluoreszierende interkalierende membranpermeables Molekül und färbt alle Zellen. Im Gegensatz dazu ist PI ein roter Fleck interkalierende und undurchlässige Membran, und daher von "gesunden" Zellen ausgeschlossen ist. Der Hersteller beschreibt, dass PI eine stärkere Affinität zu Nukleinsäuren als SYTO hat 9; Somit wird, wenn beide Flecken innerhalb einer Zelle vorhanden sind, SYTO 9 werden aus Nukleinsäuren, verschoben werden, und die Zelle (n) in rot fluoreszieren. Um zu beweisen, der Mechanismus Stocks [82] durchgeführt "zellfreien" physikalisch-chemischen Messungen mit dem "Viability Stain, Bac
Light", und konnte zeigen, dass die Färbung Prinzip nicht so einfach ist. Dieser Autor wurde eine sogenannte Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET), obwohl unter bestimmten Färbungsbedingungen, SYTO 9 Emission des PI-Emission übertrifft. die SYTO 9 zunehmender Konzentration kann somit die PI-Emission, was zu einer Doppelfärbung von Zellen zu verbessern. Aktien [82] betont mehrmals, dass für eine Interpretation der Färbung Ergebnis "die relativen Konzentrationen von PI, SYTO9 und DNA waren von entscheidender Bedeutung"
und "dass geeignete Steuerung oder Validierungsexperimente (sollte) durchgeführt".
Doppelfärbung und /oder FRET wurde auch von anderen Autoren dokumentiert [41, 83], die jeweils lebens- und formaldehyd getötet oder UVA-behandelten Kulturen untersucht, die Lebensfähigkeit Parameter. Die folgende Diskussion der Molecular Probes Handbuch sollte in diesem Zusammenhang betrachtet werden
In Bezug auf die Zuverlässigkeit der in der Biofilmforschung "Lebensfähigkeit kit" wir direkt möchten das Produktinformationsblatt zu zitieren (n) von Molecular Probes 2001. Produktinformationen, LIVE /DEAD ® BacLight ™ Bacterial Viability Kit, Stand: 26. Januar 2001, sowie Revised: 15-Juli-2004 (wobei letztere repräsentiert die aktuellste Version im Oktober 2013) [81] :( I) "... Flecken unterscheiden sich sowohl in ihrer spektralen Eigenschaften und ihre Fähigkeit, gesunde Bakterienzellen einzudringen. Wenn es allein verwendet wird, markiert der SYTO 9 stain allgemein alle Bakterien in einer Population - die mit intakten Membranen und solche mit beschädigten Membranen. Im Gegensatz dringt Propidiumiodid nur Bakterien mit beschädigten Membranen, eine Verringerung der SYTO 9 stain verursachen, wenn beide Farbstoffe vorhanden sind. Somit kann mit einer geeigneten Mischung der SYTO 9 und Propidiumiodid Flecken, Bakterien mit intakten Zellmembranen fluoreszierend grün färben, während Bakterien mit beschädigten Membranen leuchtrot beflecken. "
(II)" Die Färbung Bakterien mit entweder Kit L7007 oder L7012 - 4.1 Passen Sie die E. coli-Suspensionen (live und getötet) auf 1 × 10
8
Bakterien /ml oder die S. aureus-Suspensionen (live und getötet) auf 1 × 10
7
Bakterien /mL. S. aureus-Suspensionen sollte in der Regel 10-fach weniger konzentriert als E. coli für die Fluoreszenzmikroskopie. "
die Zahlen von E. coli
Daher und S . aureus und Videos einer Logarithmus unterscheiden.
(III) Schließlich wegen (I) eine Mischung aus 50% leben und 50% tote Bakterien zu einer 50/50 grün /rote Fluoreszenz nicht normal führen . Und umgekehrt:
50% der grün fluoreszierende Bakterien in einer Probe bedeutet nicht, dass 50% sind vitale Zellen gibt. Deshalb "grün /rote Fluoreszenz-Verhältnisse
(werden müssen) für jeden Anteil von Live /Dead E. coli berechnet."
Dieser letzte Punkt wurde bestätigt von Hannig et al . [6] in ihrem Papier über die Lebensfähigkeit von S. mutans in vitro
. Sie stellten fest, dass eine "anfängliche Konzentration von lebenden Bakterien in dem Test"
von 50% führt zu unterschiedlichen "Verhältnis Emission vital /Emission toten Bakterien"
Werte von etwa 9,5, 6,5 oder 8,0 in ihrer NaCl-Kontrollproben. Weiterhin Hannig et al. [6] heißt es: "Der Anteil der avital Bakterien wie durch das Verhältnis von avital an vitalen Zellen angegeben erhöht. Es lag im Bereich zwischen 0,1 ... und ... 29.0 ... Nachdem mit Chlorhexidin Spülung wird das Verhältnis auf 190 betrug (6 h) bzw. 10,2 (12 h) ... "
Unter den Informationen ihrer Figur eine Rechnung zu tragen, bleibt unklar, was diese verschiedenen Verhältnisse können in Bezug auf die "echten" Vitalität Werte tatsächlich bedeuten. 'S beschrieben die drei oben genannten Punkte
in der BLA Zusammengefasst Bedienungsanleitung zeigen, dass in Übereinstimmung mit Aktien [82], eine "angemessene Mischung
" der beiden Flecken müssen ermittelt und in einem Experiment sie vor der Verwendung für jede einzelne Bakterienarten hergestellt werden. Dies kann in einem in-vitro
Situation möglich sein, in denen die BLA helfen kann einige Zeit auf lange Sicht folgende kritische, vorsichtig, und zeitraubend Kalibrierstufen für jede einzelne Bakterienarten zu retten. Dies ist jedoch unmöglich, natürlich Biofilmen aufgrund der Einzigartigkeit der Plaquematrix Biofilmen zu verwalten in auftritt, wo es in Wirklichkeit mehr oder weniger als 1000 verschiedene mikrobielle Spezies [84] sein kann. Darüber hinaus ist die Anwendung des SYTO 9 /PI-Färbung ist für Biofilme als nicht geeignet betrachtet, da der Diffusionsphänomene aufgrund exo-Polymere, die "in einer Unterschätzung der Lebensfähigkeitszählungen"
führen [21].
Allerdings scheint es ein zusätzlicher Nachteil ist. Giertsen et al. [23] kritisiert erhebliche Diskrepanzen zwischen den erwarteten Biofilm Vitalität und das Ergebnis der SYTO 9 /PI-Färbung. Außerdem beschrieben die Autoren ein instabiles Verhalten und eine Änderung der Färbung Farbe von grün auf rot, das heißt
hin zu mehr "tot" Bakterien zu überwachen. Erst vor kurzem wurden diese Ergebnisse von Tawakoli et al erläutert. [7] postulieren, dass gefärbten Zellen ihre Lebensfähigkeit kurz nach der Einlagerung der Farbstoffe, Schreiben verloren: "Diese Hypothese wird durch die TEM-Analyse in der aktuellen Studie (Abbildung zwei) bestätigt wurde. Die Bilder zeigten immense Lyse und die Zerstörung der anhaftenden Zellen .... "Bei
Tabelle 3 listet eine Fülle von Studien [5-7, 9, 16-20, 22, 23, 41, 71, 73], [ ,,,0],82, 83, 85-98], die die BLA verwendet. Jedoch in fast allen Studien mussten es aufgeklärt (a), wenn plaqueartige Biofilmen oder zumindest Speichelproben wurden bewertet, oder wenn die Untersuchungen mit einzelnen Bakterienarten wurden hergestellt und /oder künstliche (monospecies) Biofilme; (B) wenn die Anfärbung Regime der Biofilm Proben eingestellt wurde gemäß dem Handbuch BLA (Validierung); (C) das Verdünnungsfaktor zwischen SYTO 9 und PI verwendet wurde, aufgrund eines Validierungsverfahren nach (b); (D), wie die Inkubation wurde verfahren, insbesondere die Inkubationszeit der Bakterienproben zusammen mit der Mischung "Flecken; (E), ob die Ergebnisse der BLA auf andere Parameter verglichen wurden, und wenn diese angemessen waren (g) oder nicht (f); (H), wenn die BLA mit den anderen Parametern passen Ergebnisse (ob passend oder nicht). Nicht zuletzt waren wir interessiert (i) ob die BLA Ergebnisse die Erwartungen der users.Table 3 Hintergrundinformationen über die Verwendung des BacLight® Assays (BLA) für die Beurteilung der (Zahn-) Biofilm Vitalität
Studien traf mit der BLA (n = 30)
[5-7, 9, 16-20, 22, 23, 41, 71, 73], [82] * [83, 85-98]
(a) wurden plaqueähnlichen Biofilmen ausgewertet
No: [5, 16-18, 22, 23, 41, 82, 83, 86], [87, 93, 96-98]
Ja: [6, 7, 9, 19, 20, 71, 73, 85], [88-92, 94, 95]
(b) Validation
No: Artikel [5, 7, 9, 16-18, 20, 22, 23, 41], [71, 73, 82, 85-91, 94-98]
Ja: [6, 19 ?, 83, 92, 93?]
(c) Verdünnungsfaktor
Nicht festgestellt: Artikel [16, 18, 23, 73, 86, 94, 95, 98]
1: 1 [6, 7, 9, 17, 20, 22, 41, 71], [85, 87-92, 96, 97]
2: 1 [93]
4: 1 [5]
6: 4 [19]
1: 6 [83]
(d) Inkubation Verfahren
Nicht festgestellt: Artikel [16, 18, 71, 86, 95, 96]
10 min, RT [6, 7, 20]
15 min, RT [5, 9, 17, 19, 22, 23, 41, 73], [85, 87 -91, 97, 98]
20 min, RT [83, 92]
& gt; 20 min, 2 ° C [93]
30 min [94]
(e) Vergleich
No: Artikel [16-18, 20, 22, 71, 82, 83, 85, 88], [90, 91, 94, 95]
Ja: [5-7, 9, 19, 23, 41, 73, 86, 87], [89, 92, 93, 96-98 ]
(f) ... mit ungeeigneten Methoden
[6, 7, 9, 19, 23, 41, 73, 86], [87, 89, 92, 93, 96-98]
(g) ... mit geeigneten Methoden
[5] *
(h) Hat die BLA auf die andere Anpassungsergebnisse Parameter
No: [7, 19, 86, 89, 92, 93] (DAPI), [96, 97]
Ja: [5, 23, 41, 93] (FDA), [98]
(i) Haben die BLA Ergebnisse entsprechen den Erwartungen des Benutzers (s)
No:? [23, 83, 86]
Ja: [5, 7, 16, 18-20, 22, 41, 71, 82], [85, 87-98]
(a) (i) Beschreibung im Text siehe
Nicht angegeben:. wurde "nach den Anweisungen des Herstellers nach" Entweder wurde keine Informationen von den Autoren gegeben, oder die Autoren festgestellt, dass die Färbung durchgeführt, was im allgemeinen einen Verdünnungsfaktor von 1 bedeutet, : 1, und einer Inkubationszeit von 15 min
* [5]:. Decker die Gesamtkeimzahlen registriert (wie BC /ml log) und der CFU (als KBE /ml log), jedoch keine Daten in Bezug auf die PE gab .
* [82]. "zellfrei" physikalisch-chemischen Messungen, den Mechanismus der BacLight Färbeverfahren aufzuklären in der Rubrik
aufgeführt von den 30 Untersuchungen in Tabelle 3 die Hälfte (15) "plaque- eingestuft wurde wie Biofilm ". Dieser hohe Anteil ist aufgrund der Tatsache, dass wir Literatur zur mündlichen Biofilme zu prüfen, bemüht. Natürliche Speichel wurde ebenfalls enthalten zB
[89-91] sowie "Mikrokosmos Plaques", die in einem künstlichen Mund gezüchtet wurden und /oder zum Beispiel waren aus Speichel etabliert [20, 71, 92] oder von einem subgingivalen Plaque Probe [96]. Einige andere Studien befasste sich mit Tiefseesedimentbakterien oder Abwasserproben [73, 93], die von uns als natürliche Multispezies-Systeme betrachtet wurden.
Es ist erstaunlich, aber zu erwarten, dass nur fünf Studien zu einem vorhergehenden Validierungsverfahren beruhten (Linie (b) in Tabelle 3) [6, 19, 83, 92, 93], von denen zwei Fällen wurden sogar bedenklich [19, 93]. Dennoch könnte eine Kalibrierungs dort übernommen werden. Die Beschreibung Filoche et al. [92] verdeutlicht die mühsamen Methodik (vgl ihre Materials & amp; Methodenteil, Ziffern 2.5 Erzeugung der Lebensfähigkeit Standard; 2.6 Herstellung der einzelnen Plaque Lebensfähigkeit Standard 2.7 Vorbereitung der gepoolten Lebensfähigkeit Standard; 2.8 Färbung Protokoll für Live- /DEAD ® BacLight ™ und 2,9 Fluoreszenzmessung und Datenanalyse). Überraschenderweise [92] die Kalibrierung dieser Autoren selbst schien zu funktionieren, wenn die Proben und Kontrollen in 4% Paraformaldehyd fixiert wurden, und /oder wurden für bis zu drei Monate gelagert.
Als Folge von größter Nutzer keine Validierung mit setzen es in den Verdünnungsfaktor Ratschläge bezüglich des Herstellers zwischen den beiden Flecken 9 und PI SYTO. Nur vier Forschungsgruppen nicht folgen die empfohlene 1: 1-Verdünnung. Interessanterweise erstrecken sich die Faktoren einen Bereich von 1: 6 bis 4: 1 (Linie (c) in Tabelle 3). Dies spiegelt im Allgemeinen die verführerische Natur des Färbeverfahren [13] und den Anforderungen der Forscher auf eine einfache und schnelle Anwendung. Die Sorge von Aktien [82], dass die relativen Konzentrationen von PI, SYTO9 und die Nukleinsäuren sind von entscheidender Bedeutung, vor allem von den Benutzern vernachlässigt wird. Auf den ersten Blick
das gleiche für die Inkubation Verfahren gilt (Linie (d) in Tabelle 3), aber dies könnte ein ernsthaftes Problem sein. Zweiundzwanzig der Benutzer angegeben habe, nicht das Verfahren oder auf den Herstellerangaben verlassen. Einige andere reduzierte die empfohlenen 15-minütige Inkubation auf 10 Minuten [6, 7, 20], während andere die Inkubationszeit zwischen den BacLight Flecken verlängert und deren Proben zu 20 oder sogar 30 Minuten [83, 92-94]. Jedoch ist die Feststellung von Tawakoli et al. [7], dass die gefärbten Zellen unter Untersuchung geändert oder verloren sogar ihre Lebensfähigkeit kurz nach der Einlagerung der Farbstoffe legt nahe, dass die "einfachen" Inkubationszeit ein wichtiger und potenziell zerstörerischen Faktor ist. Es ist, ob eine Zeit von 10, 20 oder 30 Minuten in Frage ( "im Dunkeln", aber bei Raumtemperatur, und nur einmal bei 2 ° C [93]) können eine verschlechternde Wirkung auf das Ergebnis des Färbeverfahrens ausüben. [7]. Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.
