Zusammenfassung
Hintergrund
Mikrobielle Gemeinschaften menschlichen Mund bewohnen mit oralen Gesundheit und Krankheit assoziiert sind. Frühere Studien haben die allgemeine Prävalenz von Erwachsenen Gingivitis in China angegeben hoch. Das Ziel dieser Studie war es in der Tiefe der mündlichen Mikrobiota der chinesischen Erwachsenen mit oder ohne Gingivitis zu charakterisieren, durch die mikrobielle phylogenetischen Vielfalt und Community-Struktur definiert, unter Verwendung von hoch parallelisierte Pyrosequenzierung.
Methods
Sechs Nichtraucher Chinesisch, drei mit und drei ohne Gingivitis (im Alter von 21-39 Jahren, 4 Frauen und 2 Männer) wurden in der vorliegenden Querschnittsstudie eingeschrieben. Gingival Parameter der Entzündung und Blutung bei Sondierung von einem Kliniker gekennzeichnet wurden unter Verwendung des Mazza Gingiva-Index (MGI). Plaque (getrennt von vier verschiedenen oralen Standorten abgetastet) und Speichelproben wurden von jedem Probanden erhalten. Sequenzen und relative Häufigkeit der bakteriellen 16 S rDNA-PCR-Amplicons wurden über Pyrosequenzierung bestimmt, die 400 erzeugt bp lange liest. Die Sequenzdaten wurden über eine rechnerische Pipeline für den menschlichen oralen microbiome Analysen angepasst analysiert. Des Weiteren wurden die relativen Häufigkeiten ausgewählter mikrobiellen Gruppen validiert mit Hilfe quantitativer PCR.
Ergebnisse | Die mündlichen microbiomes von Gingivitis und gesunden Probanden konnte auf der Grundlage der deutlichen Gemeinschaftsstrukturen von Plaque microbiomes unterschieden werden, aber nicht die Speichel microbiomes. Beiträge der Community-Mitglieder an Gemeinschaftsstruktur Divergenz wurden statistisch auf der phylum, Gattung und Art ähnlichen Ebenen abgerufen. Acht vorherrschende Taxa gefunden wurden im Zusammenhang mit Gingivitis: TM7, Leptotrichia
, Selenomonas
, Streptococcus
, Veillonella
, Prevotella
, Lautropia
und Haemophilus
. Weiterhin wurden 98 Arten Ebene OTUs identifiziert Gingivitis-assoziiertes zu sein, die bei einer Auflösung Spezies mikrobiellen Eigenschaften Gingivitis vorgesehen. Schließlich wird für die beiden ausgewählten Gattungen Streptococcus
und Fusobacterium
, Real-Time-PCR-basierte Quantifizierung der relativen bakteriellen Hülle und Fülle validiert die Pyrosequenzierung-basierte Ergebnisse.
Schlussfolgerungen
Dieser Methoden Studie legt nahe, dass die orale Proben aus dieser Patientenpopulation von Gingivitis kann durch Pyrosequenzierung die 16 S rDNA-Gene über Plaque microbiome charakterisiert werden. Weitere Studien, die Serienproben von Probanden (Längsschnittstudie Design) mit einer größeren Bevölkerungszahl charakterisieren kann in klinisch definierte Zustände von Gingivitis Einblick in die zeitliche und ökologische Merkmale der oralen mikrobiellen Gemeinschaften bieten.
Schlüsselwörter oral Mikrobiota Gingivitis Speichel Plaque Pyrosequenzierung elektronische ergänzendes Material
die Online-Version dieses Artikels (doi:. 10 1186 /1472-6831-11-33) enthält zusätzliches Material, das autorisierten Benutzern zur Verfügung
Shi Huang, Fang Yang. trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit.
Hintergrund
metagenomische Techniken vor kurzem unser Verständnis von der Fülle von Mikroben, die den menschlichen Körper, wie das menschliche microbiome gemeinsam bekannt gemeinsam bewohnen revolutioniert haben. Verschiedene Körperstellen (zum Beispiel die Haut, die Magen-Darm-und vaginale Traktate und der Mundhöhle) beherbergen verschiedene Gemeinschaften von Mikroben, die unter Host Einzelpersonen als auch unter den ökologischen Nischen innerhalb jeder Körperstelle [1] variieren. Wechselwirkungen zwischen resident Mikrobiota und zwischen der Mikrobiota und dem menschlichen Wirt zu Grunde liegen die menschliche Gesundheit und Krankheit. In der Mundhöhle, der Zunge, des weichen und harten Gaumen, Wangenschleimhaut, supra- und subgingivalen Oberflächen der Zähne und Speichel können repräsentieren verschiedene ökologische Nischen oder Lebensräume [2]. Die Zusammensetzung und die Vielfalt der Mikrobiota in dieser Lebensräume zu Mundgesundheit beitragen kann [3-6] und Munderkrankungen wie Karies, Parodontitis und Gingivitis [7, 8].
Gingivitis ist eine Entzündung der Weichteile des Gummis rund um die Zähne. Es wird angenommen, aus dem Aufbau von Plaque führen [9] und der damit verbundenen Wechselwirkungen zwischen dem Plaque-Mikrobiota und Wirtsgewebe [10, 11]. Diese Gewebe werden gerötete und bluten auf Sondieren, aber keine apikale Migration des Saumepithels auftritt. Frühere Studien von gingivalen Plaque zeigten, dass wie Gingivitis entwickelt, die mikrobiellen Bestandteile der subgingivalen Plaque Verschiebung aus einer Population dominiert von Gram-positive Streptokokken auf eine mit erhöhten Mengen an Gram-negative Anaerobier wie Actinobacillus
, Capnocytophaga, Campylobacter, Eikenella, Fusobactrium
und Prevotella
[2, 12, 13]. Allerdings haben diese Studien auf Kultur- und des molekularen Methoden gestützt, die nur eine begrenzte Ziel und partielle Anzahl der kultivierbaren Mikroorganismen, eine Vorspannung, die durch metagenomic Ansätze überwunden werden können. Während des letzten Jahrzehnts, basierte Hochdurchsatz-Sequenzierung Ansätze auf 16 S rDNA Amplikons verwendet wurden in Gesundheit und Krankheit, die Vielfalt der menschlichen Mund Mikrobiota zu überblicken. Bemerkenswert ist, offenbart diese Techniken die mikrobielle Vielfalt innerhalb der gesunden subgingivalen Ritze übersteigt weit über die zuvor charakterisiert wurde. Kroes et al.
Festgestellt, dass weniger als ein Viertel (24%) von Phylotypen mit metagenomic Techniken identifiziert konnte durch Kultivierung und dass fast die Hälfte der subgingivalen Phylotypen mit einer Kombination von molekularen und kulturbasierten Techniken identifiziert gewonnen werden noch nicht gewesen zuvor charakterisierten [14]. In der Tat, schätzte eine andere Studie, dass in der menschlichen Mundhöhle etwa 68% aller bakteriellen Taxa noch unbebaut waren [6].
Obwohl molekulare Techniken verwendet wurden, subgingivalen Plaques bei gesunden Wirte und die mit oralen Erkrankungen wie Parodontitis zu vergleichen [ ,,,0],15], nur wenige Studien haben in der Tiefe der mündlichen Mikrobiota im Zusammenhang mit Gingivitis untersucht. Es gibt mehrere Gründe. Zuerst
, die Tiefe und Breite der Probenahme für die orale Mikrobiota haben im allgemeinen unzureichend, und die optimalen Parameter nicht für die von Gingivitis Patienten insbesondere bestimmt. Zweitens
, die Auswahl der Zahnfleischstellen für Plaque-Probenahme in Bezug auf, es war immer noch nicht klar, ob oder welche der verschiedenen Standorte sind klinisch relevanten (zum Beispiel Frontzähne oder Backenzähne? Supragingival Plaque oder subgingivale Plaque?). Eine solche Zweideutigkeit stark begrenzt aussagekräftige Datenanalyse und Vergleiche zwischen den Studien und verzögert die Übersetzung der Erkenntnisse klinisch. Drittens
, die meisten oralen mikrobiellen Umfragen, die 16 S-Sequenzen von PCR-Amplicons aufgezählten ignoriert mögliche PCR-Artefakte [16-19]; als Ergebnis eine umfassende und genaue organismal Landschaft der meisten oralen microbiomes, insbesondere solche auf Krankheiten im Zusammenhang blieb weitgehend ungeklärt. All diese Faktoren haben die Bewertung der mikrobiellen Faktoren verwechselt mit Gingivitis in Verbindung gebracht.
Einsatz Pyrosequenzierung von 16 S rDNA Amplikons, erläutert dieser Artikel die Vielfalt und die Bevölkerungsstruktur der mündlichen Mikrobiota, abgetastet jeweils aus fünf oralen ökologischen Nischen von jedem der drei chinesische Erwachsene mit Gingivitis und drei ohne die Krankheit. Mikrobiota von supragingivalen Plaque, subgingivale Plaque und Speichel wurden charakterisiert zu prüfen, ob und wie die microbiomes aus den verschiedenen oralen ökologischen Nischen unterscheiden gesunde Wirte und die mit Gingivitis. Unsere Studie eine Reihe von Organismen als potentielle Biomarker für Gingivitis geortet und lieferte wichtige Erkenntnisse für die Probenahme und Analyse Strategien zur Entwirrung Gingivitis-assoziierten mikrobiellen Risikofaktoren in menschlichen Populationen.
Ergebnisse | Studiendesign
Die sechs Probanden waren gesund, Nichtraucher in Alter Erwachsene 21 bis 39 Jahre (Tabelle 1) reichen. Gruppenzuordnung wurde auf der Grundlage der Häufigkeit von Blutungen bei Sondierung (BOP). Drei Personen wurden auf die gesunde Gruppe zugeordnet (H) auf der Grundlage einer BOP Frequenz ≤5 und drei Themen, die die ungesunden (Gingivitis) Gruppe (U) auf der Grundlage einer BOP Frequenz von ≥ 20 Gruppe H bestand aus drei Frauen und der Gruppe U enthalten zwei Männer und eine Frau. Bluten-Indizes der einzelnen Probanden wurden in Tabelle 1 1.Table Metadaten für die sechs Probanden in dieser Studie Stichprobe gezeigt.
Gruppe
Gesunde (H)
Ungesundes (U)
Thema ID
1
2
3
4
5
6
Gender
F
F
F
F
M
M
Age
22
23
21
39
25
25
Smoking
N
N
N
N
N
N
Chronic disease
N
N
N
N
N
N
BOP
5
1
1
24
37
25
MGI
1.1250
1.0357
1.0179
2.1346
2.6071
1.9286
Abkürzungen: BOP - Bluten beim Sondieren; MGI - Mazza Gingival Indizes
Sequence Datensätze
Fünf Proben (jeweils von einem anderen oralen Seite, siehe Methoden) von jedem einzelnen gesammelt und analysiert wurden. BarCoded 16 S-rDNA Amplikon-Sequenzierung 454 Titan (durchschnittliche Leselänge von 400 bp) ergeben insgesamt 494.988 roh mit liest, in einem Datensatz von 258.385 resultierenden liest (nach strengen Qualitätsbeurteilung und Kontrollmaßnahmen, Methoden). Die Anzahl der Lesevorgänge pro Probe von 4405 reichte bis fast 13.562, mit einem Durchschnitt von 8612 (Tabelle 2) .Tabelle 2 Schätzungen der Artenvielfalt für die Proben.
Host-ID
Standortspezifische spezifische~~POS=HEADCOMP Probe
ID
Probe Raw liest
Reads analysiert Einzigartige Sequenz
Good-Coverage
OTUs bei 3% Unterschied
Ace
Chao 1
1
S
H1
18805
11580
3120
98.13%
687
902.15
944.54
A-sup
H2
18448
9764
2307
98.56%
464
603.62
634.17
|
A-sub
H3
15895
8035
2748
97.98%
597
740.87
775.64
|
P-sup
H4
13974
7467
2142
96.69%
684
966.39
925.12
|
P-sub
H5
14224
7730
2528
97.12%
702
932.10
923.01
2
S
H6
20982
11907
3264
98.35%
685
877.19
884.03
|
A-sup
H7
19416
10935
2415
98.99%
379
491.50
490.02
|
A-sub
H8
17295
9539
2060
98.66%
390
533.27
523.25
|
P-sup
H9
22178
10085
2653
97.98%
631
846.61
842.29
|
P-sub
H10
23105
10809
3160
98.06%
736
928.09
937.33
3
S
H11
19146
10970
3229
98.11%
612
847.56
878.51
|
A-sup
H12
12515
5476
1933
97.11%
515
672.34
680.37
|
A-sub
H13
13289
6581
1829
97.80%
466
608.60
631.71
|
P-sup
H14
13105
6615
1896
97.57%
494
657.40
661.27
|
P-sub
H15
12673
6456
1943
97.23%
539
728.34
757.23
4
S
U1
24258
13562
3929
98.50%
671
880.91
876.01
|
A-sup
U2
18719
9591
2190
98.20%
495
700.72
713.79
|
A-sub
U3
16282
7651
2636
97.56%
638
819.36
805.22
|
P-sup
U4
20539
10035
3045
98.33%
617
766.07
749.34
|
P-sub
U5
11515
5272
1963
96.47%
597
776.19
772.56
5
S
U6
20527
12890
3150
98.02%
722
1012.09
1001.18
|
A-sup
U7
14307
7813
2436
97.82%
589
746.85
748.61
|
A-sub
U8
14763
8078
2793
97.83%
621
785.67
781.26
|
P-sup
U9
14787
7268
2213
97.14%
589
818.53
828.20
|
P-sub
U10
16246
8916
2902
97.73%
656
858.40
934.10
6
S
U11
15739
8819
2569
97.74%
606
806.46
824.90
|
A-sup
U12
12849
5407
2013
96.10%
570
819.64
810.82
|
A-sub
U13
17990
8484
2844
97.15%
737
996.50
984.13
|
P-sup
U14
9112
4405
1330
95.87%
475
678.74
671.08
|
P-sub
U15
12305
6249
2189
96.13%
698
959.80
960.71
Reichhaltigkeit und Vielfalt Analyse basierend auf Operational taxonomischen Einheiten
die einzigartigen Sequenzen Clustering in operative taxonomischen Einheiten (OTUs) bei einer 3% igen genetischen Distanz führte zu 464 ~ 737 verschiedene "Artniveau" Phylotypen pro microbiome (Tabelle 2). Für alle der oralen mikrobiellen Gemeinschaften analysiert, erfasst die Anzahl der OTU war sehr nahe an der Gesamtzahl der OTU geschätzt durch CHAO1 und ACE Reichtum Indikatoren. Das durchschnittliche Niveau der guten Berichterstattung war über 97% in allen Proben, was darauf hinweist, dass etwa drei neue Phylotypen für jede weitere 100 sequenzierten liest zu erwarten wäre. Dieser Grad der Abdeckung vorgeschlagen, dass die 16 S rDNA identifiziert Sequenzen, die die Mehrheit der bakteriellen anwesenden Mitglieder in Speichel und Plaque-Proben, die in der aktuellen Studie darstellen. Die einzelnen rarefaction Kurven zeigten ein ähnliches Muster der zunehmenden Vielfalt, die Sättigung (Figur 1) noch nicht erreicht hat. Vergleiche der rarefaction Kurven in der gesunden (H) und Gingivitis (U) Populationen in die Stichprobe einbezogenen Standorte von Speichel und Plaque zeigte, dass die beiden Host-Gruppen ähnlich Reichtum der bakteriellen OTUs bei 97% Identität Ebene angezeigt. Abbildung 1 Schwund Kurven für H und U-Gruppen an den abgetasteten Stellen von Speichel und Plaque. Für beide Speichel Plaque microbiomes, H und U-Gruppen ähnlich phylogenetischen Vielfalt bei 97% Identität Ebene angezeigt (basierend auf bis zu 4.000 Sequenzen pro Probe).
Vergleiche von Gemeinschaftsstrukturen
ob der Mikrobiota aus dem Speichel und Plaque Um zu bestimmen, aufstrebenden gesunde Wirte und die mit Gingivitis, wurden multivariate Analysen die Gesamtstruktur von Mikrobiota von jeder oralen ökologische Nische basierend auf FastUnifrac abgeleiteten und thetaYC-basierten Distanzmatrizen zum Vergleich angewendet. FastUniFrac [20] ermöglicht es paarweise Vergleiche der evolutionären Abstände zwischen zwei mikrobiellen Gemeinschaften und Maßnahmen Ähnlichkeiten zwischen den mikrobiellen Gemeinschaft Strukturen. In der PCoA-Analyse unter einem gewichteten UniFrac Schema Segregation zwischen H und U-Gruppen beobachtet (p
& lt; 0,001), wenn alle Proben oder wenn nur Plaqueproben wurden in Betracht gezogen, aber nicht, wenn nur Speichelproben wurden geprüft (2A ). Darüber hinaus unabhängig von ihrem Host-Gruppenzugehörigkeit, gebildet Speichel Mikrobiota eine deutliche Cluster aus der Plaque-Mikrobiota (p = 0,034
) (2B, C). Die thetaYC basierte PCoA-Analyse zeigte, konsistente Ergebnisse (3A, B). Wenn nur Plaqueproben betrachtet wurden, war die strukturelle Trennung zwischen "H" und "U" Gruppen differenzierter (p
= 0,001) (3C), als wenn alle Proben enthalten waren (p = 0,005
) (Abbildung 3A). Daher gingivitis- und gesund gingival-microbiomes kann auf der Grundlage der deutlichen Gemeinschaftsstrukturen von Plaque microbiomes unterschieden werden, nicht jedoch die Speichel microbiomes. Abbildung 2 Vergleich der Bakteriengemeinschaft Strukturen wie durch FastUniFrac gemessen. Gemeinschaftsstrukturen aus H und U Gruppen (A) oder von den verschiedenen Standorten (B) wurden unter Verwendung verhört Hauptkoordinatenanalyse (HKoA) und Clustering-Analyse des gewichteten UniFrac Distanzmatrix. Jeder Punkt entspricht einer mikrobiellen Gemeinschaft, mit Farbe anzeigt, seiner Kategorie. Prozentuale Anteile der Veränderung durch die gezeichneten Hauptkoordinaten erklärt wurden auf den Achsen angezeigt.
3 ThetaYC-basierte Analyse der bakteriellen Gemeinschaft Strukturen Abbildung. Gemeinschaftsstrukturen aus H und U Gruppen (A) oder von den verschiedenen Standorten (B) wurden unter Verwendung verhört Hauptkoordinatenanalyse (HKoA) von thetaYC Distanzmatrix. Jeder Punkt entspricht einer mikrobiellen Gemeinschaft, mit Farbe anzeigt, seiner Kategorie. Prozentuale Anteile der Veränderung durch die gezeichneten Hauptkoordinaten erklärt wurden auf den Achsen angegeben.
Taxonomie-basierte Charakterisierung von oralen Mikrobiota
Bakterielle Stämme und Gattungen wurden durch taxonomische Zuordnung für Referenzdatenbanken identifiziert und quantifiziert MOTHUR, die ihre relative Häufigkeit offenbaren in allen der Plaque und Speichel microbiota (4; wurden nur phyla gezeigt). Alle Sequenzen wurden verteilt in 11 Bakterienstämme gefunden, die sechs vorherrschende phyla umfassen üblicherweise in der Mundhöhle auftreten: Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Fusobakterien und TM7 [6, 21]. Die relative Abundanz aller phyla Plaque in jeder der beiden Host-Gruppen nachgewiesen vorgeschlagen, dass signifikante Unterschiede für die meisten der phyla zwischen Hosts mit oder ohne Gingivitis, außer Firmicutes, Proteobacteria und Spirochaeten (Abbildung 5) gefunden wurden. Unter denen Gingivitis-assoziiertes phyla, Actinobacteria und Bacteroidetes waren Gingivitis abgereicherte während die verbleibenden fünf phyla waren Gingivitis angereicherte (Abbildung 5). Abbildung 4 Wiegende Phylotypen in jeder Probe. Über 90% der Vielfalt in jeder Probe wurde durch die sechs phyla beigetragen. Jedoch wurden Variationen in ihrer relativen Abundanzen gefunden. Siehe Methoden für Abkürzungen.
5 Vergleiche von bakteriellen Taxonomie Profile von H und U-Gruppen auf phylum Ebene Abbildung basierend auf oral "CORE" Datenbank. Die relative Häufigkeit der einzelnen Taxa zwischen den H- und U-Gruppen wurden mit Metastats verglichen (*: 0,01 & lt; p & lt;
0,05; **: p & lt;
0,01; Mittelwert ± SEM)
A. insgesamt 70 Gattungen wurden in der Mund microbiota aus den fünf Stichprobenstellen (Zusatzdatei 1) identifiziert. Die am häufigsten Taxa auf Gattungsebene nachgewiesen werden (die 12 am häufigsten vorkommenden Gattungen, die jeweils mindestens 2% der oralen microbiome darstellt) waren Streptococcus, Neisseria
, Leptotrichia, Actinomyces, Prevotella
, Veillonella, Rothia, Fusobacterium
, Lautropia
, Selenomonas, Haemophilus, Granulicatella
.
Statistisch gesehen, 26 Gattungen wurden unterschiedlich verteilt zwischen Gingivitis Plaques (Gruppe U) und gesund-gum Plaques (Gruppe H) (Tabelle 3) gefunden. Fünf Gattungen (Streptococcus, Veillonella, Prevotella
, Lautropia
und Haemophilus
) waren signifikant häufiger bei gesunden-gum Plaque Mikrobiota als die von Gingivitis Plaque, während die restlichen 21 Gattungen gefunden wurden statistisch weniger häufig zu sein .Tabelle 3 Bakteriengattungen zwischen H und U-Gruppen auf der Grundlage der mündlichen "CORE" Datenbank.
Genera
unterschiedlich verteilt
H
U
Metastats p-Wert
Metastats q-Wert
|
bedeuten Fülle (%)
std.err
bedeuten Fülle (%)
std.err
|
|
Streptococcus
22,47%
1,91%
14,32%
1,98%
0,010989
0,0043
Veillonella
8,62%
1,90%
2,33%
0,77%
0,002997
0,0016
Prevotella
6,07%
1,75%
1,27%
0,44%
0.004995
0,0023
Lautropia
5,67%
2,00%
1,33%
0,31
%
0.013986
0,0051
Haemophilus
4,15%
1,39%
0,58%
0,21%
0,000999
0,0008
Leptotrichia
4.12%
0.91%
12.48%
2.44%
0.002997
0.001644
Selenomonas
1.73%
0.36%
6.71%
1.70%
0.002997
0.001644
Uncultured_Lachnospiraceae*
1.00%
0.27%
1.97%
0.25%
0.015984
0.0056366
Eubacterium
0.34%
0.08%
1.89%
0.34%
0.000999
0.000822
Cardiobacterium
0.60%
0.17%
1.19%
0.22%
0.038961
0.011658
Peptostreptococcus
0.19%
0.10%
1.42%
0.46%
0.002997
0.001644
Tannerella
0.20%
0.05%
1.36%
0.49%
0.000999
0.000822
Catonella
0.36%
0.10%
1.06%
0.25%
0.006993
0.003139
Synergistes
0.07%
0.03%
1.22%
0.49%
0.001998
0.001409
Filifactor
0.05%
0.04%
0.96%
0.28%
0.000999
0.000822
Peptococcus
0.12%
0.04%
0.49%
0.11%
0.004995
0.002349
Solobacterium
0.11%
0.03%
0.46%
0.22%
0.048951
0.01381
SR1
0.11%
0.04%
0.42%
0.08%
0.000999
0.000822
Syntrophomonas
0.00%
0.00%
0.17%
0.07%
0.000999
0.000822
Johnsonella
0.01%
0.01%
0.14%
0.05%
0.000999
0.000822
Choroflexus
0.01%
0.01%
0.12%
0.07%
0.030969
0.010172
Olsenella
0.01%
0.00%
0.05%
0.02%
0.041958
0.012185
Propionivibrio
0.00%
0.00%
0.05%
0.02%
0.032967
0.010172
Peptoniphilus
0.00%
0.00%
0.04%
0.02%
0.000999
0.000822
Desulfomicrobium
0.00%
0.00%
0.02%
0.01%
0.000999
0.000822
Pseudoramibacter
0.00%
0.00%
0.02%
0.01%
0.000999
0.000822
Bei Gattungsebene identifizierten wir 26 Gingivitis-assoziierter Taxa in Plaque Mikrobiota, die fünf Gingivitis verarmten Taxa enthalten (fett) und 21 Gingivitis angereicherten Taxa (ohne fett); *, Nicht eine gut definierte Gattung.
OTU-Level-Vergleiche von oralen Mikrobiota
diejenigen liest mit Vertrauenswert von über 0,8 (Methoden), im Wesentlichen alle Wie die obigen Vergleiche wurden von nur abgeleitet von der relativen Häufigkeit von mikrobiellen Taxa diejenigen liest, ohne dass zuverlässige phylogenetischen Zuweisungen (0,33 ~ 27,86% der gesamten in jeder Probe liest) maskiert worden war. Deshalb haben wir weiter im Vergleich zwischen den beiden Host-Gruppen, die relative Häufigkeit aller Spezies-Ebene OTUs in Plaque-Mikrobiota, unabhängig von ihrer phylogenetischen Identitätszuweisungen. Insgesamt 98 OTUs (Anteil von 5,38% des gesamten OTUs) wurden bei der Bedeutung Cutoff von 0,05 differentiell verteilt gefunden (beide p und q
-Wertes
-Wert von Metastats) nicht nur in jedem der vier plaque Websites, sondern auch in allen Plaque-Sites. Interessanterweise unter den 98 OTUs, 36 von ihnen waren Gingivitis verarmte und die restlichen 62 waren Gingivitis angereicherte (Weitere Datei 2). Consensus Taxonomie der OTUs wurde von MOTHUR basierend auf oral "CORE" 16 S rDNA Gene-Datenbank (Methoden) abgefragt. Vierundzwanzig aus dem 36 Gingivitis-Abbau OTUs während 57 aus dem 62 Gingivitis angereicherten OTUs durch die Taxonomie-Zuordnung basiert Ergebnisse unterstützt wurden. So ergibt sich aus den beiden Methoden sind weitgehend konsistent. Diese Gingivitis abgereicherte oder Gingivitis angereicherte OTUs stellen eine neue Menge von potentiellen organismal Marker für die Auswertung und Prognose von Gingivitis, obwohl ihre Gültigkeit und Bedeutung bleiben weiter in größeren menschlichen Populationen getestet werden.
Correlation mikrobieller Quantifizierungen zwischen Pyrosequenzierung und quantitative PCR (qPCR), die Abundanz, in Genkopien pro ng DNA aus zwei Gattungen (Streptococcus
und Fusobacterium
) in allen der Plaque und Speichel-Proben wurden mit qPCR bestimmt. Die relative Häufigkeit dieser beiden Gattungen wie durch Pyrosequenzierung bestimmt eine positive Korrelation zu den qPCR-basierte Gen-Kopien pro ng DNA (Streptococcus
zeigte: r
= 0,554; p
& lt; 0,002; Fusobacterium
:. r
= 0,813; p
& lt; 0,001) (Weitere Datei 3)
Diskussion
dieser Studie die Vielfalt und Populationsstruktur von zu beurteilen hoch parallelisierte Pyrosequenzierung von 16 S rDNA eingesetzt und vergleichen Mikrobiota im Zusammenhang mit Gingivitis in der chinesischen Erwachsenen. Die mikrobielle Vielfalt in Plaque und Speichel in unserer Studie wird geschätzt, 464 ~ 737 OTUs (97% Identität Cutoff) in jeder Probe war ähnlich wie berichtet von Zaura et al (Speichel, [5]). Die Zaura Studie eingesetzt, um eine strenge und konservative Lese-Trimm Strategie, in dem nur die Anwesenden mindestens fünf Mal in einer Probe liest wurden in die Analyse entnommen. In unserer Analyse, strenge Qualitätsbasierte Lese Trimmen von MOTHUR vorgeschlagen wurde durchgeführt und erfordert durchschnittliche Qualitätsfaktor von mehr als 35 in einem 50 bp bewegendes Fenster entlang der gesamten Lese (Methoden). Diese konservative Auswahlkriterium http:. //Www. Mothur org /wiki /signifikant die Anzahl der OTUs von den Schätzungen auf der Basis alternativer Lesetrimm Kriterien wie erfordern durchschnittliche Basisqualitätsfaktor & gt reduziert; 25 (Daten nicht gezeigt). So Potential Sequenzierung Artefakte könnte die beobachtete bakterielle Vielfalt aufzublasen. Außerdem ergab die geschätzte Gut die Abdeckung, dass die meisten der Bakterien Phylotypen (& gt; 97%) in den Speichel und Plaque dieser gesunden und Gingivitis hosts bereits in dieser Studie identifiziert wurden. Die Reichhaltigkeit Schätzer von ACE und CHAO1 auch vorgeschlagen, dass die Mehrheit der Phylotypen (& gt; 97%) wurden bereits durch die Sequenzen in unserer Studie dargestellt
Unsere Studie zunächst Ziel zu beurteilen, ob Gemeinden von gesunden und Gingivitis-assoziierten Wirtspopulationen unterscheiden. in jeder spezifischen Stelle (n) der Mundhöhle. Sowohl FastUnifrac Basis und thetaYC basierte Analyse zeigte, dass Speichel und Plaqueproben dargestellt deutliche microbiomes in der Mundhöhle. Unabhängig von Krankheitsstatus, geclustert Speichel microbiota deutlich von Plaque microbiota, in jeder der beiden Abstands Matrizes getestet. Dies spiegelt wahrscheinlich die verschiedenen Umweltbedingungen Charakterisierung der beiden Lebensräume. Plaque microbiota residieren in Biofilmen auf der Zahnschmelzoberfläche und werden durch diätetische Zusammensetzung, Mundhygienepraktiken [22], mikrobieller Wechselwirkungen innerhalb des Biofilms [8] und Wechselwirkungen zwischen Mikroben und Host Epithelzellen [10, 11, 23] beeinflusst. Im Gegensatz dazu wurde die Speichellebensraum durch die Nahrungsaufnahme Fluss geformt, vorübergehende Mikrobiota, Mucinen, seröse Exsudat, abgestoßen Epithelzellen usw. [3, 4, 24, 25]. Interessanterweise berichtete eine Umfrage der globalen Vielfalt der menschlichen Speichel microbiome in zehn Personen aus jeder von zwölf geografischen Standorten weltweit (einschließlich China) eine hohe Vielfalt innerhalb und zwischen den Host-Individuen, aber wenig geographische Struktur in den Speichel microbiomes [26].
Zweitens wurden die Mitglieder der Bakteriengemeinschaften identifiziert. Darüber hinaus ihren Beitrag zur strukturellen Trennung von Plaque Mikrobiota zwischen den beiden Wirtspopulationen wurden ausgewertet. Wenn Plaque microbiota auf der Ebene der Phylum, Fusobakterien und TM7 betrachtet wurden, zwei der vorherrschenden phyla waren reichlicher in Mikrobioten mit Gingivitis verbunden, während Actinobacteria und Bacteroidetes waren weniger reichlich in Gingivitis-assoziiertes microbiomes. Auf der Ebene der Gattung, mehrere Gattungen wie Leptotrichia
und Selenomonas
waren häufiger in Gingivitis Plaque (21 solcher Gattungen insgesamt, Tabelle 3), während nur fünf Gattungen Streptococcus
, Veillonella
, Prevotella
, Lautropia
und Haemophilus
, waren weniger reichlich vorhanden. Bei Artniveau, Phylogenie-Zuordnung unabhängigen Vergleich der relativen Häufigkeiten von OTUs zwischen den gesunden und Gingivitis Gastgeber wurde nicht nur für jede der vier Plaque-Sites durchgeführt, sondern auch alle der Plaque-Sites. In Übereinstimmung mit den oben genannten Feststellungen, 98 Gingivitis-assoziierten (beide Gingivitis angereicherte und Gingivitis abgereicherte) OTUs wurden geortet und in allen Untersuchungsstellen von Plaque verteilt gefunden. Zudem 58 OTUs zu den Gattungen von Leptotrichia
verbundenen (16), Selenomonas
(12), Streptococcus
(7), Veillonella
(6), Prevotella
(6), Lautropia
(2), Haemophilus
(3) und der Kandidat Teilungs TM7 (6) gefunden wurden mit Gingivitis in Verbindung gebracht werden.
Bemerkenswerterweise mehrere Mitglieder dieser Gingivitis-assoziierter Taxa bekannt waren, eine Rolle zu spielen sowohl die orale Gesundheit und Krankheit. Die Gingivitis angereicherte Gattung Leptotrichia
, der Fusobakterien phylum und Fusobacteriaceae Familie, waren gramnegative nicht Sporing bildende, anaerob, saccharolytischen Stangen. Sie gehörten zu den normalen Mikrobiota in der gesunden Mundhöhle [27] und Darm [28]. Leptotrichia buccalis
wurde in hoher Prävalenz in einer Studie der Sulkus der chinesischen Patienten mit Gingivitis und nekrotisierende Colitis Gingivitis [29] gefunden. In einem Modell von Gingivitis experimentell induzierten, beherbergte Kinder-drei fach höhere Anteile an Leptotrichia
Arten und 2,3-fach höhere Anteile an Selenomonas
Arten in subgingivalen Plaque als Erwachsene in der gleichen Weise behandelt [30]. Ebenso Selenomonas
Arten sind gramnegative Anaerobier normalerweise gefunden in der Mundflora und in Verbindung mit Gingivitis [31, 32] und Periodontitis [33, 34]. TM7 ist eine prominente bakterielle Stamm von über 200 Phylotypen ohne kultivierten Vertreter [35-37] und in verschiedenen Umwelt Lebensräume (wie Boden, Süßwasser, Tiefsee und hydrothermale Quellen) gefunden. Die Mitglieder des TM7 Kandidaten Division wurden in verschiedenen menschlichen Körperstellen vor kurzem entdeckt worden [6, 38-40], und im Zusammenhang mit der entzündlichen Pathogenese verschiedener Erkrankungen (Parodontitis [41], Vaginose [42] und chronisch entzündlichen Darmerkrankungen [43]) . Die Untergruppe I025 wurde gefunden in subgingivalen Plaque in erster Linie an erkrankten Stellen in Parodontitis Gastgeber, was darauf hindeutet, ihre mögliche Rolle in der multifaktoriellen Prozess, der zu Parodontitis [41, 44].
Auf der anderen Seite, nur fünf Gingivitis verarmten Gattungen entdeckt in die aktuelle Studie. Streptococcus
ist eines der vorherrschenden Gattungen in der menschlichen Mundhöhle. Allerdings sind die "oral streptococci" eine sehr heterogene Gruppe genetisch [45]. Obwohl die meisten opportunistischen Erregern sind und mit einer Vielzahl von oralen Erkrankungen in Verbindung gebracht worden [46-48], werden sie auch Kommen betrachtet. Ähnlich wie unsere Ergebnisse, Streptococcus sanguinis
sowie Lautropia mirabilis
und Haemophilus parainfluenzae
wurden vor kurzem mit der Mundgesundheit assoziiert [34, 47]. Die Gattung Veillonella
eine Gruppe von kleinen darstellt, in der Regel nicht-fermentativen, streng anaerob, Gram-negative Kokken. Sie sind in der menschlichen Mundhöhle, der oberen Atemwege, des Dünndarms und Vagina gefunden. In einer Umfrage von subgingivalen Plaque von 22 Probanden wurden die Mehrheit der subgingivalen Veillonella
Isolate identifiziert als Veillonella parvula
[49]. Prevotella
Arten sind Teil der normalen menschlichen Mund microbiota und werden häufig getrennt von oralen Infektionen wie Parodontitis, Zahnkaries und Abszesse [15, 50, 51]. Black-Pigmentieren Mitglieder von Prevotella
mit oralen Erkrankungen in Verbindung gebracht wurden. Konsequent in dieser Studie gehörten die meisten Prevotella
OTUs entdeckt bei gesunden Hosts Spezies außer Prevotella tannerae
nicht Pigmentieren. Einmal in größeren Erhebungen validiert diese Gingivitis-assoziierten Gattungen, einschließlich Gingivitis angereicherter und Einsen abgereichert wertvolle Biomarker für Gingivitis darstellen.
Pyrosequencing Techniken, wie die in dieser Studie verwendet, offenbarte große phylogenetischen Vielfalt und Variabilität Bakteriengemeinschaften in der menschlichen Mund Ökosystem [20, 52]. Charakterisierung und Quantifizierung der Gemeinschaft Komponenten erlaubt Unterschiede in Gemeinschaftsstruktur zwischen gesunden und kranken Zustand für Krankheit Biomarker und spezifische-Mikroben-gezielte Therapie erforscht werden. Unseres Wissens ist dies die erste organismal Umfrage von Gingivitis-assoziierten Mikrobiota Tiefsequenzierungstechniken. Unsere vorläufigen Ergebnisse formulieren die Grundlage für weitere Studien, die eine Längs Design und verfügen über eine größere Anzahl von Themen verfügen. Die laufende technische Verbesserungen auf phylogenetischen-Marker-Amplifikation (wie jene Targeting DNA-Extraktion Bias-Sequenz Chimärismus durch PCR, Bias der PCR-Amplifikation, Sequenzierung Fehler, ungleiche Verstärkung der Community-Mitglieder und die typischerweise unbekannten Variationen in den rDNA-Gen-Kopienzahlen verursacht unter verschiedene Bewohner [16-19, 53]) und die zunehmende Abdeckung der oralen 16 S rDNA Referenzdatenbanken [54] sollte bei noch höheren Empfindlichkeit und Auflösung der Präparation von Gingivitis-assoziierten mikrobiellen Faktoren ermöglichen.
Schlussfolgerungen
dieser Studie zuerst, dass ergab, microbiota von den vier Messstellen für plaque (supragingivale Plaque und subgingivalen Plaque von Frontzähnen; supragingivale Plaque und subgingivalen Plaque von Zahnbereich; Methods) einander ähnlich waren, jedoch waren unterscheidbar von Speichel Mikrobioten. Zweitens Gemeinschaftsstrukturen von Plaque Mikrobiota, aber nicht Speichel Mikrobiota, kann verwendet werden, Gingivitis zu unterscheiden. So bei der Bereitstellung einer mikrobiellen Perspektive als Probenahmestelle der Wahl dienen für die Krankheit Plaque sollte. Drittens wurde eine Reihe von Organismen, die als Gingivitis-assoziierten (mit mehreren Low-Fülle Gingivitis spezifischen Gattungen nachgewiesen; Tabelle 3), die als potentielle Biomarker dienen können. Diese Ergebnisse haben wichtige Auswirkungen auf die Probenahme- und Analysestrategien für die Vermessung Gingivitis-assoziierten mikrobiellen Risikofaktoren. Unsere Ergebnisse ermöglichen nun weitere Studien, die die zeitliche Entwicklung und die Epidemiologie von mikrobiellen Risikofaktoren hinter Gingivitis untersuchen. 0,05; Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.
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