Zusammenfassung
Hintergrund
Die Tetrodotoxin-resistente spannungsgesteuerten Natriumkanal Na
v1.8 (SNS1 /PN3) von Nozizeptoren exprimiert wird und kann spielen . eine Rolle bei der Schmerzzuständen
Methoden
unter Verwendung spezifischer Antikörper für die Immunhistochemie, untersuchten wir Na v1.8 - Immunreaktivität in der menschlichen Zahnpulpa in Bezug auf die neuronalen Marker Neurofilament. Menschlicher Zahn Zellstoff aus Zähne extrahiert wurde von insgesamt zweiundzwanzig Patienten (vierzehn ohne Zahnschmerzen, acht Patienten mit Zahnschmerzen) geerntet.
Ergebnisse | Fibres immunoreaktiv für Na v1.8 wurden deutlich erhöht auf die Bildanalyse in der schmerzhaften Gruppe: Median (Bereich) Na v1.8 auf Neurofilament% Flächenverhältnis, nicht schmerzhafte 0,059 (0,006 bis 0,24), schmerzhafte 0,265 (0,13 bis 0,5), P
= 0,0019.
Fazit
Na v1.8 Natriumkanäle somit ein therapeutisches Ziel bei Trigeminus Schmerzzuständen | Electronic ergänzendes Material
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Hintergrund
Schmerz ist das häufigste Symptom von erkrankten Zahnfleisch ist, oft eine Folge von koronalen Karies des Zahnes zu beeinflussen bis zu 80% der westlichen Bevölkerung im Laufe ihres Lebens. Die reifen menschlichen Zahnpulpa ist dicht innervated mit über 900 Axone die durchschnittliche menschliche Prämolaren Eingabe [1], die aus dem Trigeminusganglion stammen. Die normale Zellstoff scheint unempfindlich Reize zu exterozeptiven; aber in pathologischen Zuständen, elektrische, thermische, mechanische und chemische Reize alle produzieren eine nozizeptive Reaktion [2]. Primäre und dauerhafte Zahnpulpa enthalten 70-90% C-Fasern [3], myelinated Fasern hauptsächlich aus der A-Delta Kategorie [3], mit wenigen myelinated Fasern der A beta-Gruppe. Die Mehrzahl der Nervenfasern im koronalen Bereich des Breis zu beenden, einen subodontoblast Plexus, mit 40% Abschluss in den Dentintubuli Nähe der Odontoblastenfortsätze bilden [3]. Starke Korrelationen wurden zwischen der zuführenden Entladungsfrequenz von menschlichen Zellstoff Nozizeptoren und Schmerzniveaus [4] berichtet. Viele Vorschläge wurden für die Entstehung von Pulpa Schmerz gemacht z.B. Zellstoff Entzündung innerhalb der Zellstoff (cholinerge und adrenerge Neurotransmitter, Prostaglandine und zyklisches AMP) liegt mehrere Vermittler beteiligt sind. Doch bisher hat sich kein Zusammenhang zwischen Schmerzcharakteristika und Histologie der Pulpe [5, 6].
Spannungsgesteuerten Natriumkanäle spielen eine Schlüsselrolle in der Pathophysiologie des Schmerzes und unterscheiden sich je nach ihrer Empfindlichkeit gegenüber dem Neurotoxin etabliert Tetrodotoxin (TTX) so schnell aktivierende TTX-sensitive (TTX-S) Kanäle oder langsam inaktivierende TTX-resistente Kanäle (TTX-R). Die Verteilung und die Pathophysiologie dieser Kanäle, insbesondere Na v1.8, (SNS /PN3) in den Mittelpunkt der Forschung in der Schmerzmechanismen gewesen [7]. Vor kurzem blockiert Antisense-Behandlung diesen Kanal neuropathische Schmerzen reduziert [8]. Wir haben zuvor beschrieben, die zeitliche und räumliche Verteilung von Na v1.8 in menschlichen Sinnesneuronen [9]; Die Kanäle wurden in Sinneszellkörper nach Wurzel avulsion Rückenmark, aber in Fasern proximal zu der Stelle der Verletzung in Plexus brachialis Stämme akkumuliert und in neuromas verringert akut. Basierend auf dem Vorhandensein von Na v1.8 in überwiegend kleinen mittelgroßen Neuronen im menschlichen DRG, ist es wahrscheinlich, dass Na v1.8 sowohl in einem Delta und C-Fasern vorhanden ist [9, 10].
Ziel zu beurteilen, ob der Pulpa Schmerzen im Zusammenhang mit Karies im Zusammenhang mit einer Änderung der Na v1.8-Immunreaktivität innerhalb Zahnpulpa Nervenfasern verbunden war.
Methoden
Patienten für Zahnextraktion geplant bei Guy Dental Institute, London, wurden in die Studie aufgenommen, spätere Zustimmung in Übereinstimmung mit der lokalen Forschungsethikkommission zu bieten.
22 permanente molaren etwa getestet werden extrahiert, 1 Stunde vor der Extraktion, für Vitalität eines elektrischen Pulpentester mit (analytische Technologie Konstantstrom in der Mitte bukkalen Oberfläche des Zahnes) und Ethylchlorid, das neuronale Vitalität der Pulpa zu bestätigen. Ein Schmerz Geschichte wurde auch (bestehende Schmerzen und Dauer) gesammelt. Die Patienten wurden in zwei Gruppen eingeteilt, die mit bestehenden Schmerzen vom Zahn (n = 8 Patienten Altersbereich: 40,3 ± 4,0 Jahre) und diejenigen, die keine Geschichte oder bestehende Schmerzen (n = 14 Patienten Altersbereich: 37,3 ± 14,6 Jahre) . Die Geschlechterverteilung der Gruppen war M: F 1: 1. Alle Zahnschmerzen in dieser Studie auf Pulpitis zurückzuführen war aufgrund umfangreicher Karies des Mahlzahn, die Schmerzdauer betrug 2,9 Wochen (Bereich 0,5-8) und die Indikation zur Extraktion der nicht-schmerzhaften Zähne war Perikoronitis. Alle Zähne wurden durch Standard-Mund Ansatz unter örtlicher Betäubung oder Vollnarkose entfernt. Im Anschluss an das Extraktionsverfahren (Dauer weniger als 5 min) wurden die Zähne vertikal mit einem wassergekühlten Bohrer geschnitten und die Pulpe herausgehoben, und Proben sofort schockgefroren bei -70 ° C. Vorsätzliche Untersuchung der Kronenpulpa, einschließlich der dicht subontoblastic Schicht innervated wurde auf einer markierten sterilen Karte durch eine sorgfältige Ausrichtung der Zellstoff unterstützt. Basierend auf der Anzahl von Entzündungszellen vorhanden ist, wurde die Entzündung in Übereinstimmung mit den örtlichen histologischen Standardskalen benotet, die leichter, mittelschwerer oder schwerer waren.
Immunhistochemie
Gefrorene Zellstoff oder Nerven wurden in OCT-Medium eingebettet (RA Lamb, London , UK) und Abschnitten von 12 um Auftau-mounted auf Glasobjektträger vorbeschichtet mit poly-L-Lysin. Die Schnitte wurden in frischem 4% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) für 30 min immersionsfixiert, dann durch Inkubation blockiert endogene Peroxidasen mit alkoholischer 0,3% Wasserstoffperoxid für weitere 30 min. Die Schnitte wurden über Nacht mit einem monoklonalen Antikörper gegen den neuronalen Marker Neurofilament (Klon 2F11, Dako, Cambridge, UK, verwendet bei einem Endtiter von 1:10, 000) und eines polyklonalen Antikörpers gegen das Na v1.8 (K107 inkubiert ), deren Spezifität von uns zuvor beschrieben wurde [9]. Seiten des primären Antikörpers Bindung wurden unter Verwendung von Avidin-Biotin-Peroxidase-Methode (Vector Elite ABC-Methode, Vectastain, Novacastra, Newcastle, UK) enthüllt. Präparationen wurden in 1% w /v wässrige Neutralrot zu visualisieren Kerne und fotografiert mit einem Olympus Photomikroskop gegengefärbt. Spezifität Studien des Na v1.8 Antikörper (K107), zeigt eine positive Färbung in der menschlichen DRG-Neuronen und keine Färbung in der Vor-Absorptionsexperimenten mit Na v1.8 Peptid in Zahnpulpa Abschnitte wurden wie zuvor ausgeführt [9] beschrieben.
Bildanalyse
Na v1.8 und Neurofilament Immunreaktivität in Fasern wurden unter Verwendung von computergestützten Bildanalyse (Seescan Cambridge, UK) quantifiziert. Die Quantifizierung der Daten wurden 12 Mikron dicke Serienschnitte durchgeführt werden. Die Bilder wurden per Video-Link zu einem Olympus BX50 Mikroskop (x40, Ziel) und gescannt von Computer erfasst. Einstellen Graustufennachweisgrenzen bei Schwelle, hervorgehoben positive Immunfärbung, und der Bereich der markierten Fasern wurde in% Bereich des Feldes abgetastet erhalten. Scannen wurde pro Gewebeschnitt zufällig für mindestens 5 Felder durchgeführt längsgerichteten, in einem Blindversuch bewertet; 3 Gewebesektionen aus jeder Zellstoff wurden analysiert und der Mittelwert von jedem Patienten erhalten. Die Ergebnisse sind als durchschnittliche prozentuale Verhältnis des mittleren Na v1.8 zu Neurofilament reaktiven Fasern in 5 Felder ausgedrückt
Analyse
Der Mann Whitney-Test zu vergleichen Verhältnisse zwischen den Gruppen verwendet wurde. P
weniger als 0,05-Werte wurden als signifikant angesehen.
Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt Neurofilament-Färbung des Pulpa Horn eines Mahlzahn Hervorhebung der Beziehung des subodontoblastic Plexus (boxed-Bereich) in die tieferen relativ ärmer koronalen innervated Zellstoff bei geringer Vergrößerung. Immunfärbung zeigte die Anwesenheit einer großen Anzahl von Nervenfasern innerhalb der menschlichen Zahnpulpa, die Neurofilament immunoreaktiv waren (Fig. 2A und B). Eine Untergruppe von Nervenfasern wurde auch mit dem Na v1.8-Antikörper (Fig. 2C und D) in den beiden nicht-schmerzhaften und schmerzhaften Zellstoffgruppen immunhistochemisch. Die Spezifität der Na v1.8-Antikörper wurde durch Methoden für diesen Antikörper von uns in der menschlichen DRG [9], einschließlich der Unterlassung des primären Antikörpers und der Vorinkubation mit Peptid beschrieben demonstriert. Abbildung 1: Mikroskopische Aufnahme zeigt die Pulpa Horn eines Mahlzahn, Hervorhebung der Beziehung des subodontoblastic Plexus (boxed-Bereich) zu den tieferen Kronenpulpa. Vergrößerung × 10
2 Immunoreaktives Nervenfasern in nicht-schmerzhaften (linke Spalte) und schmerzhaft (rechte Spalte) menschlichen Zahnpulpa Abschnitte, in Zellstoff aus schmerzhaften Zähnen innerhalb des subontoblastic Plexus Region 'eingerahmt' in Abbildung 1. Die Färbung mit Antikörpern zu Nav1.8 (A und C) und Neurofilament (B und D). Die Pfeile zeigen Nav1.8 immunoreaktive Nervenfasern. Vergrößerung × 40
durch Bildanalyse, Neurofilament Faser Median% Bereich (Bereich) in nicht-schmerzhaften Zahn Zellstoff war 13.94 (3,05-22,05) und in schmerzhaften Zahn Zellstoff war 18.21 (9,11-27,88); es gab Trend für eine Erhöhung, aber dies war statistisch nicht signifikant. Es gab eine signifikante Änderung des entsprechenden Na v1.8% Fläche in nicht-schmerzhaften 0,68 (0,13-2,90) im Vergleich zu einer schmerzhaften Zahn Zellstoff 5,855 (1,3-7,52), P
& lt; 0,005. Es wurden auch deutlich mehr Fasern immunostaining für Na v1.8 in Beziehung zu Neurofilament positiven Fasern in der schmerzhaften Zellstoff, im Vergleich zu denen ohne Schmerzen (Abb 3). Der Median Na v1.8 auf Neurofilament% Flächenverhältnisse waren für nicht-schmerzhaften 0,059 (0,006 bis 0,24) und für schmerzhafte 0.265 (0,13-0,5), P
& lt; 0,005. Ein Grad der Entzündung wurde bei allen schmerzhaften Zellstoffproben gesehen. Abbildung 3 Scattergramm von Nav1.8 zu Neurofilament Verhältnis der% Bereich bei der Kontrolle und schmerzhaften Zahn Zellstoff. Der Medianwert wird angezeigt * P & lt; 0,005.
Diskussion
Neurofilament positive Fasern wurden zuvor in der menschlichen Zahnpulpa, einschließlich feiner unmyelinated Fasern in der Unter Odontoblastenschicht [11, 12] berichtet. Aber bisher gab es in den menschlichen Zahnpulpa wenige Untersuchungen der Expression von Ionenkanälen wurde. Wir haben zum ersten Mal, dass zahlreiche Na v1.8-immunoreaktive Nervenfasern sind in der menschlichen Zahnpulpa in der subodontoblastic Schicht und die Na v1.8-immunoreaktive Fasern wurden erhöht in Gegenwart von Karies nachgewiesen -induzierte schmerzlich Pulpitis. Zwar gibt es eine Tendenz zur Erhöhung der Neurofilament-Fasern in schmerzhaften Pulpa war, war dies nicht statistisch signifikant. Eine Zunahme der Nervenfasern innerhalb entzündeten Pulpa, möglicherweise aufgrund von Nerven Sprießen wurde in der Ratte Zahnpulpa nach Dentin Verletzung [13], und andere Studien berichten über eine erhöhte Neuropeptid-Expression und keimen im menschlichen infizierten Zahnpulpa [14 zuvor berichtet , 15]. Im Gegensatz zu unseren Ergebnissen für Na v1.8 in dieser Studie, unsere früheren Studie von TRPV1 und P2X3-Rezeptoren zeigte keine signifikante Veränderung der schmerzhaften Zahn menschlichen Zahnpulpa [16].
Die Gegenwart von Na v1 0,8-immunoreaktive Neuronen in der Schicht subodontoblastic identifiziert impliziert, dass diese Rezeptoren in der Signaltransduktion bei der Pulpe-Dentin-Übergang beteiligt sein können. Es ist bekannt, daß sensorische Neuronen und Odontoblasten in unmittelbarer Nähe vorhanden sind, aber keine synaptic oder elektrische Verbindungen identifiziert worden [2, 12] postuliert, dass die Odontoblasten-neuron Verbindung neurochemical sein kann. Eine Infektion oder Schädigung der Pulpa Gewebe können zu einer Entzündung, einer erhöhten Expression von Substanz P ergibt, CGRP und Sicherheiten Nerven sprießen, die durch den Nervenwachstumsfaktor reguliert werden (NGF), die auch Na v1.8 Ausdruck durch sensorische reguliert Neuronen [7]; NGF ist selbst in entzündeten Pulpa Gewebe erhöht [17]. Die Entnahme von gesunden nicht-schmerzhaften Zellstoff aus brach teilweise dritten Molaren, obwohl entwicklungs reifen kann nicht repräsentativ sein, voll Molaren Breie ausgebrochen. Fibre Zahlen und Rezeptorexpression kann nach Ausbruch des Zahns zu ändern [2]; es bleibt unklar, ob Na v1.8-Immunreaktivität mit Ausbruch oder Reife der Zähne variiert.
Obwohl unsere Kreuzreaktivität und Pre-Resorptionsstudien Spezifität der verwendeten Antikörper zeigte, sollten die Daten mit Vorsicht interpretiert werden. Immunfärbung von Nerven erscheint in dieser Studie, und nicht an den Knoten Ranvier axoplasmic sein. Kürzlich [18] Henry und Kollegen haben Na berichtet v1.8-Immunreaktivität im Zusammenhang mit den Knoten von Ranvier im radicular menschlichen Zahnpulpa. Der Unterschied in der Lokalisierung zwischen den Studien Charakteristika der Antikörper und Immunfärbungsverfahren widerspiegeln könnte, und weitere Studien, einschließlich verschiedener Techniken und funktionellen Assays notwendig sind. Die relative Expression von Na v1.8-immunoreaktive Fasern positive Fasern Neurofilament niedrig ist - dies kann auch für die Affinität der in dieser Untersuchung verwendeten Antikörper zurückzuführen sein, oder die Expression dieses Ionenkanals in einer kleinen Unter reflektieren Satz von Nervenfasern. Die spezifische Art von Faser exprimierenden Na v1.8, die Verteilung von Na v1.8 gesamten menschlichen Zahnpulpa und die Längenänderungen in der Na v1.8-Immunreaktivität durch Pulpa Entzündung verursacht, alle weiteren Studie erfordern.
Fazit
Abschließend Nervenfasern in Pulpa von Patienten mit Zahnschmerzen zeigten signifikant mehr Na v1.8-Fasern als Anteil an der Neurofilament positive Fasern. Als Na v1.8 hat bei neuropathischen Schmerzen in Verbindung gebracht, dessen Expression von Nervenfasern innerhalb der menschlichen Zahnpulpa kann auf die Pathophysiologie von Zahnschmerzen beitragen. Weitere Untersuchungen des zeitlichen Verlaufs der Erkrankung und der Schwere der Schmerzen und /oder Entzündungen, sind notwendig, um die Rolle und die Regulierung der Na v1.8 Ionenkanäle in der Pathophysiologie von Schmerzen trigeminal aufzuklären. Na stellt v1.8 ein Ziel für neue Analgetika.
Erklärungen
Danksagung kaufen Wir Eddie Odell und sein Team danken, Klinik für Mund-, Pathologie, GKT Dental Institute, Kings College London. Wir danken auch Kevin Coward für die Hilfe bei Pilotstudien.
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Der Autor (en) erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Beiträge der Autoren
TR alle chirurgischen Verfahren durchgeführt wird, extrahiert die Zahnpulpa und half dem Papier schreiben. YY nahmen an der Immunhistochemie, die Analyse von Daten und entwarf das Manuskript. CP, ST und CB waren verantwortlich für das Design und die Produktion der NaV1.8 Antikörper verwendet, Hilfe bei der Interpretation der Daten und das Schreiben des Manuskripts. CB beteiligte sich an der Konzeption der Studie, die Entwicklung von Antikörpern und der Interpretation der Daten. PA konzipierte die Studie und beteiligte sich an der Gestaltung und Koordination, die Auslegung und die Fertigstellung des Manuskripts. Alle Autoren gelesen und genehmigt das Manuskript.
