Cytochrom-Oxidase und NADH-Cytochrom-c-Reduktase-Aktivitäten wurden biochemisch in gingiv.il hiops & gt analysiert; Proben von 22 männlichen Patienten (Alter 23-72) unterzogen Parodontalbehandlung erhalten. Histologisch. 13 Proben zeigten leichte Entzündung, während 9 schweren Entzündungsreaktionen zeigten. Cytochromoxidase-Aktivität war signifikant höher in der leicht entzündet als in stark entzündete Gewebeproben. NADH-Cytochrom c-Reduktase-Aktivität auf der anderen Seite wurde durch den zunehmenden Grad der Entzündung nicht signifikant verändert. Die mögliche Bedeutung der Wirkung von Entzündung bei oxidativer Enzyme in Bezug auf degenerativen und proliferative Veränderungen diskutiert in den beiden Gewebetypen auftreten.
Einführung
Cytochrome Oxidase (E.C1.9.3.1 .) und Cytochrom C-Reduktase NADH (ECI, 6. 2. I.) im wesentlichen normalen menschlichen Gingiva bestimmt wurden (Eichel & amp; Sharhrik 1964), allerdings sind diese Parameter nicht zuvor in Bezug auf die Effekte auferlegten von Zahnfleischentzündung untersucht. Endogene Atmung Studien zeigten, dass die QOj in milden Gingivitis stimuliert wird, und deprimiert in stark entzündeten Zahnfleisch (Glickman el al 1949, Manhold & amp;. Volpe 196,1). Auf der anderen Seite den letzten Polarographie Studien (Zajieck & amp; Kindlová 1972) ergab, dass anfängliche QO_. Werte blieben in menschlichen Gingiva konstant und wurden durch den Grad der Entzündung nicht signifikant verändert. Angesichts dieser unterschiedlichen Ansichten möchten wir auf die Wirkung der Entzündung auf Cytochrom-Oxidase und NADH-Cytochrom c-Reduktase-Aktivitäten insgesamt Homogenaten von menschlichen Zahnfleisch zu melden.
Methoden und Materialien
Gewebepräparation
Human gingivalen Biopsien irom 22 männlichen Patienten gewonnen wurden (Alter 23-72), parodontale Behandlung. Die Leitungsanästhesie verabreicht wurde Infiltration des Gewebes zu vermeiden. Das Gewebe wurde chirurgisch entfernt und geschnitten in zwei Teile, von denen für die histologische Untersuchung vorbereitet. Das andere wurde in kaltem 0,075 M Phosphatpuffer pH 7,0 gewaschen. anhaftende Blut zu entfernen und schnell gefroren bei - 70 & deg; C auf Trockeneis. Die fro /en gingivalen Proben nach der Entnahme innerhalb eines Tages für ihre enzymatische Aktivität analysiert. Gingival Homogenate wurden durch eine Modifikation der Verfahren (Hoober & amp; Bernstein 1966) hergestellt tor Homogenisieren von Rattenhaut verwendet. Der gefrorene Gingiva (25 -5U mg Naßgewicht.) Wurde in flüssigem N, (-270'C) für 3 Minuten und pulverisiert, um kleine körnige Fragmente eingetaucht. Die Gingiva-Fragmente wurden in kaltem Puffer in Ten Broeck gemahlenes Glas Homogenisator homogenisiert, die mit einer Spieltoleranz o ((1,1-0,15 mm zu passen geschliffen wurden. Die enzymatischen Aktivitäten wurden unmittelbar nach Gewebehomogenisierung bestimmt.
Enzymanalyse
Cytochrome-Oxidase (EC 1. 9. 3. 1.) (Wainio et al 1951). spektrophotometrisch hy im Anschluss an die Oxidation von Dithionit reduziert Cytochrom c * bei I al 25 bestimmt & deg; C in einem Gilford-Spektrophotometer Modell 2400. in nil Experimenten die Autooxidationsrate von lerrocytoehrome c vor der Zugabe des Enzyms war vernachlässigbar. die E.VHI "", Absorptionswerte für Homogenat Absetzen waren zum größten Teil vernachlässigbar (0,0% in 16 und Proben), wo entdeckten sie von 0 reichte, (12-13,0 ";. der enzymatischen Wert die durchschnittliche Abwicklungswert betrug 2,5 & plusmn;. 0,9 ci für die 22 Proben, die analysiert wurden Werte Einschwingzeit wurden bestimmt durch erneute Verringerung der Reaktions Medien mit überschüssigem Dithionit, das Homogenisat in den Reaktionsmedien Resuspendieren und nach der Änderung der optischen Extinktion bei graphisch Ejaonni Vs- Zeit. Die Einschwingzeit Werte wurden aus der gesamten beobachteten Absorptionswert in den betroffenen Enzymassays erhaltenen subtrahiert und die spezifischen Aktivitäten wurden aus den korrigierten Werten bestimmt. Die Reaktionsmischung enthielt: 75 mM KH..PO | -Na, .HPO4 Puffer pH 6,75. 5,6 uM Cytochrom c und (25-150) jig Protein (homogenale) in einem Endvolumen von 300 u. Cytochrome c Konzentration von millimolaren Extinktionskoeffizienten von Cytochrom c H bestimmt wurde - ,, -,;, t] ll = 18,5 mm 'cm' für die reduzierte minus oxidiert cvtoehrome c
NADH-Cytochrom c-Reduktase.. NADH-Cytochrom c-Reduktase (E. C. 1. 6. 2. 1.) (Jeng et al. 1968) wurde durch Befolgen der Reduktion von Cytochrom c bei Er ,, Tnm bei 25ºC bestimmt. Millimolaren Extinktionskoeffizienten für Cytochrom c in der Cytochromoxidase-Assay verwendet wurde für diesen Test verwendet. Das Testsystem enthielt: 33 mM KHiPOi-NaoHPO, pH 7,75 Puffer, S.2 FTM Cytochrom c, 3.0mm KCN, 85 /LIM NADH ** und (25-150) ^ g Protein (Homogenat) in Endvolumen.. 300 II.
Spezifische Aktivitäten
Die spezifischen Aktivitäten als nanomoies von Cytochrom c ausgedrückt werden, oxidiert (Cytochrom-Oxidase) oder reduziert (Cytochrom-c-Reduktase NADH) pro mg Protein pro min.
Proteinbestimmung
Gewebehomogenate (10-20 /A) wurden bei 25 & deg für eine Stunde in 0,05 N NaOH (Endkonzentration) verdaut; C und für die Protein nach der Methode von Lowry et al .. analysiert ( 1951). Kristalline Albumin *** wurde als Standard verwendet.
Statistik
Der Mittelwert, Standardabweichung und Standardfehler wurden für jede Gruppe bestimmt. Werte, die die Grenzwerte & plusmn; 1,96 SD wurden verworfen. Der Unterschied zwischen jeder Gruppe wurde von der "Student t" Test und alle Werte p analysiert. Pulverisierung des (Ausgabe, Auftauen und anschließender Homogenisierung erscheint die Zellen ausreichend zu stören. Der Nachweis für diese Interpretation in der Beobachtung liegt, dass die Verteilung der Cytochrom-c-Reduktase NADH sowohl leicht entzündet und stark entzündeter Gingiva nicht signifikant unterschieden sich. Wenn der Rückgang der Cytochrom-Oxidase durch unsere Gewebepräparationstechniken beeinflusst wurde, ähnliche Ergebnisse sollten in den NADH-Cytochrom-c-Reduktase-Verteilungen beobachtet werden. die Menge des in unserem Testsystem Absetzen wurde zum größten Teil als vernachlässigbar gefunden und es konnte nicht für den deutlichen Rückgang Konto in Cytochrom-Oxidase-Aktivität in deutlich entzündete Zahnfleisch beobachtet.
Die erhöhte cylochiomc-Oxidase-Aktivität in unserer Studie beobachteten deckt sich mit den Beobachtungen von Manhold und Volpj (1963) in ihrer endogenen QCK Atmung Studien von leicht entzündet und wuchernden menschlichen Zahnfleisch. der Anstieg der QOL & gt; und Cytochrom-Oxidase in Gingiva reflect kann mitochondriale hohe Energie Bindung (ATP) Synthese erhöht, was die hoch synthelic Prozesse erforderlich ist mit der DNA-Synthese, Mitose und Zellproliferation assoziiert aufrechtzuerhalten. Ein weiterer Beweis für die erhöhten Anforderungen bioencrgelic in der Pre-proliferierenden und proliferative Stadien der Zellentwicklung ist die Beobachtung, dass QOL erhöht. (Endogene Atmung) (Glickman el al. 1949) und Cytochrom-Oxidase (Fine 197 (1) erreicht Spitzen in Aktivität zu einer Zeit, wenn größere Erhöhungen der mitolic Index und die Proliferation (epitheiialization) auftreten bei der Regeneration von gingivalen und Hautwunden. Auf der Andererseits seits~~POS=HEADCOMP ihe starken Rückgang der Cytochrom-Oxidase und endogenen Qoo beobachtet in deutlich entzündet (Manhold & amp;. Volpe 1963 Giickman et al 1949) gtngiva erscheinen Reflexionen von Veränderungen innerhalb der Mitochondrien sowie anderen subzellulären Komponenten während des signifikanten Gingivagewebe Zerstörung auftreten werden . Wir waren nicht imstande, eine Zunahme der Cytochromoxidase in deutlich entzündet und proliferierenden Gingiva delect. obwohl Erhöhungen der endogene QO. von Giickman et al nachgewiesen wurde. (1949) in dieser Art von gingivalen Pathologie. jedoch ist es denkbar, lhal als Entzündungs abklingt, eine prä-Phase (S-Phase der Mitose) tritt in den Zellen am Wundrand der Migration, die eine erhöhte ATP-Synthese erforderlich ist. Anschließend wird eine Erhöhung der endogenen QOL. wird ebenfalls beobachtet. Unsere Cytochromoxydase Daten und die für die endogene Atmung QOj gemeldeten Daten stimmen nicht überein mit der polarographischen QO. Beobachtungen von Zajieek und Kindlová (1972), der Thai die anfängliche QO_ & gt berichtet; Werte blieben in menschlichen Zahnfleisch konstant und wurden durch den Grad der Entzündung nicht signifikant verändert.
NADH-Cytochrom c-Reduktase-Aktivität nicht wesentlich durch den Grad der Entzündung in menschlichen Zahnfleisch verändert wurde. Unsere Daten für menschlichen Zahnfleisch parallel zu der Beobachtung von Eichel und Shahrik (1964), für den menschlichen nicht entzündeten Zahnfleisch. NADH cylochrome c-Reduktase-Aktivität war signifikant höher als cytohrome oxidase in unseren Untersuchungen festgestellt, die mit der Beobachtung von Eiehcl und Shahrik gemacht korreliert