Zusammenfassung
Hintergrund
Recombinant bone morphogenetic protein zwei (rhBMP2) hat sich für eine Vielzahl klinischer Anwendungen in der orthopädischen Chirurgie und Zahnbehandlungen verwendet worden. Trotz der weit verbreiteten Einsatz wurden Bedenken hinsichtlich seiner kurzen Halbwertszeit erhöht und transiente Bioaktivität in vivo. Jüngste Untersuchungen sollen bei rhBMP2 von einer kürzeren Polypeptidkette synthetisiert Entwicklung (108 Aminosäuren) wurde vorgenommen.
Methoden
Die osteopromotive Eigenschaften von BMP-2 auf das Zellverhalten untersucht wurden. Fünf Konzentrationen von rhBMP2_108 einschließlich 10, 50, 100, 200 und 500 ng /ml wurden verglichen mit einem im Handel erhältlichen rhBMP2 (100 ng /ml). Jede der Arbeitskonzentrationen von rhBMP2_108 wurden MC3T3-E1 Osteoblasten untersucht auf ihre Fähigkeit, Osteoblasten-Rekrutierung, Proliferation und Differenzierung zu induzieren, wie bewertet durch alkalische Phosphatase (ALP) -Färbung, Alizarin-Rot-Färbung, und Echtzeit-PCR für die Gene, die für ALP, Osteocalcin (OCN), Kollagen-1 (COL-1) und Runx2.
Ergebnisse | die Ergebnisse zeigen, dass alle Konzentrationen von rhBMP2_108 signifikant Zellrekrutierung verbessert und die Proliferation von Osteoblasten bei 5 Tage nach der Aussaat. Darüber hinaus hatte rhBMP2_108 die stärkste Wirkung auf die Differenzierung der Osteoblasten. Es wurde festgestellt, dass rhBMP2_108 über eine vierfache signifikanten Anstieg der ALP-Aktivität bei sieben und 14 Tage nach der Aussaat und die Konzentrationen von 50 bis 200 ng /ml reicht hatten gezeigt, die ausgeprägteste Wirkung. Die Analyse der Echtzeit-PCR für Gene, die für ALP, OCN, COL-1 und Runx2 weiter bestätigt dosisabhängigen Anstieg auf 14 Tage nach der Aussaat. Darüber hinaus zeigte Alizarin-Rot-Färbung eine konzentrationsabhängige Zunahme der Färbung bei 14 Tagen.
Fazit
Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen, dass diese kürzere Polypeptidkette von rhBMP2_108 ist ebenso als bioaktive als im Handel erhältliche rhBMP2 für die Rekrutierung von Vorläufer Zellen, die durch ihre Differenzierung in Richtung der Osteoblasten-Linie zu erleichtern. Zukunft in-vivo-Studie notwendig sind, um seine Bioaktivität zu untersuchen.
Schlüsselwörter BMP2 Osteoinduktive Osteoinduktion Osteoblasten Differenzierung Gesteuerte Knochenregeneration Hintergrund
Der Einsatz von Wachstumsfaktoren und Biomaterialien mit Knochen auslösenden Eigenschaften hat eine entscheidende Rolle bei der Behandlungsmöglichkeiten spielte für Patienten, die an einer Vielzahl von Knochendefekten entweder durch Bruch oder Krankheit [1-3] verursacht leiden. Osteoporose, eine Krankheit, die durch niedrige Mineraldichte und die anschließende Fragilität gekennzeichnet [4] erreicht jetzt schätzungsweise 200 Millionen Menschen weltweit mit 80% sind Frauen nach der Menopause [5-7]. Der deutliche Anstieg der Knochenstoffwechselerkrankungen in Kombination mit traumatischen durch Sportunfälle verursachten Verletzungen, Verkehrsunfälle und andere damit verbundene Frakturen erfordert Knochen induzieren Mittel, die Beschleunigung der Knochenregeneration häufig bei ungünstigen Szenarien wie osteoporotische Frakturen [8-11].
Ein Wachstumsfaktor, der mit FDA-Zulassung wurde weit verbreitet ist, dass der morphogenetischen Knochenproteine (BMPs) [12-14]. BMPs wurden zunächst aus entmineralisierten Knochenmatrix extrahiert und es zeigte sich, dass diese niedermolekulare Proteine, die die Fähigkeit bewiesen, in Tieren extraSkelettStellen ektopischen Knochen zu bilden [15, 16]. Seitdem haben BMPs der Lage, eine Vielzahl von Knochendefekten zu regenerieren und haben ihre Differenzierung zu knochenbildenden Osteoblasten [17] gezeigt, Zellrekrutierung, Proliferation und Differenzierung von mesenchymalen Zellen zu verbessern und zu beschleunigen. Trotz der klinischen Vorteile von rekombinanten Proteinen, wurden Bedenken in Bezug auf ihre vorübergehende Bioaktivität, Protein Instabilität, schnelle Auflösungsraten und kurze Halbwertszeit [18]. Aus diesen Gründen sind die Verwendung von rhBMPs typischerweise in hohen supraphysiologischen Dosen verabreicht, die das Risiko von möglichen Nebenwirkungen im Zusammenhang mit deren Verwendung [19] trägt. Darüber hinaus werden andere Faktoren, die zu einer reduzierten in-vivo-Bioaktivität umfassen die Rolle von Antagonisten und deren Spezifität für unterschiedliche BMPs (Noggin, chordin, dan), die Rolle des Wirtsorganismus für die Expression (E.coli vs. CHO) und die führen könnte assoziierten Unterschiede in Glykosylierungsmustern, die auf Unterschiede in der Bioverfügbarkeit und der Stabilität führen könnte [20-22].
Vor kurzem hat die Entwicklung eines neuen rekombinanten Proteins aus einer kürzeren Polypeptidkette von BMP2 hergestellt wurde mit dem Ziel der Verbesserung der Proteinstabilität durchgeführt in vivo. Diese kürzere Proteinkette wird angenommen, Proteinfaltung zu erleichtern, wodurch möglicherweise die Bioaktivität von rhBMP2 verbessern, indem die Halbwertszeit des Proteins zunehmende [23]. Doch vor Tierversuche, eine vollständige Charakterisierung dieser kürzeren Aminosäure-Sequenz wurde auf das Verhalten der Zellen in vitro untersucht. MC3T3-E1 Präosteoblasten wurden auf ihre Reaktion auf fünf verschiedenen Konzentrationen von rhBMP2_108 10, umfassend untersucht, 50, 100, 200 und 500 ng /ml und im Vergleich zu handelsüblichen rhBMP2 Kontrolle bei einer Konzentration von 100 ng /ml (R & amp; D-Systeme ). rhBMP2_108 wurde auf seine Fähigkeit getestet Zellrekrutierung, Zellproliferation, alkalische Phosphatase-Aktivität zu induzieren, Alizarin-Rot-Färbung als auch mRNA-Spiegel für Gene, die für alkalische Phosphatase, Osteocalcin, Kollagen ein und Runx2 durch Echtzeit-PCR gemessen als.
Methods
rhBMP2_108 Aminosäuresequenz
rhBMP2_108 wurde freundlicherweise von Jiuyuan Biotech-Unternehmen (Hangzhou, China) zur Verfügung gestellt. Die verkürzte Aminosäuresequenz wurde wie folgt hergestellt: MKKLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR für eine Proteinkette von 108 Aminosäuren. Das im Handel erhältliche BMP2 wurde von R & amp gekauft;. D Systems (Minneapolis, USA)
Herstellung von BMP2
Gemäß der Aminosäuresequenz, die intrazelluläre Expression von rhBMP2_108 in E. coli wurde wie zuvor für die Massenproduktion von rhBMP2_108 konstruiert beschrieben [24]. Kurz gesagt wurde die Sequenz von BMP2 entworfen nach seiner Aminosäuresequenz und dann mit reverser Transkriptase (Gibco BRL, NY, USA) wurde revers transkribiert, wie vorstehend [24] beschrieben. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde verwendet, um die cDNA kodierend für die verkürzte Aminosäuresequenz rhBMP2_108 Proteins zu amplifizieren. Diese rhBMP2_108 cDNA wurde dann subkloniert eine pRSET (A) unter Verwendung von Vektor (Invitrogen, UK), um den pRSET (A) /rhBMP2_108 Expressionsvektor zu ergeben. Dann pRSET (A) /rhBMP2_108 wurde weiter den E. coli BL21 (DE3) -Stamm zur Transformation verwendet. Ein Bioreaktor wurde dann zu erhalten hohe Zelldichte-Kultivierung von E. coli verwendet. Kurz gesagt, wurde transformierte E. coli in einem 5 L Fermenter mit 3 l des definierten Mediums (Batch-Kultur; Hefeextrakt 1 g /l Pepton 2 g /L) mit der Vorkultur (10% der Charge inokuliert Kulturvolumen). Die Kultivierung wurde für 48 h bei 30 ° C, einschließlich der Zugabe von einem Nährmedium (Glucose 33,3 g /l, Pepton 10 g /L, Hefeextrakt 5 g /L, MgSO
41 g bei 250 Upm unter Rühren durchgeführt, /L, FeSO 48,0 g /l, CaCl 20,048 g /l, ZnSO 40,0176 g /l, CuSO 40,008 g /l). Die kultivierten Biomasse
wurde dann geerntet durch zweimal die Zellen in einem Französisch Presse Zerkleinern und danach zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 25 mg Naßgewicht /ml in einem Suspensionspuffer (20 mM Tris-HCl [pH 8,5], 0,5 mM EDTA, 2% [v /v] Triton X-100) resuspendiert. Die Einschlusskörper (Pellets) wurden über Nacht in einem Solubilisierungspuffer (6Mguanidine-HCl, 0,1 M Tris-HCl [pH 8,5], 0,1 M DTT, 1 mM EDTA) inkubiert und danach unter ständigem Rühren bei Raumtemperatur resuspendiert. Unlösliche Teilchen wurden dann aus der Suspension durch Zentrifugation entfernt. TÜV-Heparin-Sepharose 6 Fast Flow-Säule dann die aktive rhBMP2_108 zu reinigen verwendet wurde (Dimer). Kontinuierliches NaCl-Gradienten (0,1-1,5 M) wurde verwendet, um das gebundene Protein zu eluieren. Anschließend wird eine gestufte NaCl-Gradienten (0,15 M, 0,3 M und 0,5 M) wurde verwendet, um die aktiven rhBMP2_108 Protein zu eluieren und zu trennen. Danach wurde rhBMP2_108 Pulver bei -20 ° C eingefroren. Wenn verwendet, wurde 0,1% -ige Essigsäure verwendet, um das BMP2 Pulver zu lösen. Steuerung rhBMP2 wurde von R & amp gekauft; D Systems (Minneapolis, USA), die von CHO-Zellen.
Zweidimensionale Migrationsassay
MC3T3-E1 pre-Osteoblasten-Zelllinie wurde für diese Studie verwendet. Keine menschlichen oder tierischen Proben wurden verwendet und somit keine ethische Zustimmung erforderlich war. Der Migrationstest von Zellen wurde mit einem Transwell-Kammer, die eine Platte mit 24 Vertiefungen und Polycarbonat-Filter (Transwell Costar, Corning, Acton, MA) mit einer Porengrße von 8 & mgr; m unter Verwendung von durchgeführt, wie zuvor beschrieben [25]. 10 4 MC3T3-E1-Zellen in 50 & mgr; l DMEM wurden in das obere Kompartiment beimpft. rhBMP2_108 bei Konzentrationen von 0, 10, 50, 100, 200 und 500 ng /ml und Kontroll rhBMP2 bei 100 ng /ml wurden in die untere Kammer ausgesät. Die Zellen wurden für 24 h bei 37 ° C in einem befeuchteten 5% CO 2 -Atmosphäre wandern kann. Der Filter wurde dann entfernt, die Zellen für 20 min in 4% Formaldehyd fixiert wurden und in PBS gewaschen, nachdem die Waschlösungen, Filter für 15 min bei Raumtemperatur mit Methylrosanilnium Chloridlösung (Wuhan Google Biotechnologie GmbH G1014) inkubiert wurden, dann wurden die Filter für 10 min mit PBS gewaschen. Proben wurden durch Mikroskopie untersucht. Nicht-gewanderten Zellen auf der oberen Seite wurden durch Spülen der Filter mit kaltem PBS und Abschaben mit einem Gummiwischer eliminiert. Die verbleibenden migrierten Zellen auf der unteren Seite des Filters wurden in neun zufälligen Feldern pro Filter (100 × Vergrßerung) gezählt. Alle Proben wurden in dreifacher Ausführung mit drei unabhängigen Experimenten durchgeführt durchgeführt.
Proliferationsassays
die Wirkung von rhBMP2_108 auf die Proliferation von MC3T3-E1, CCK-8-Test für jede Gruppe zu untersuchen, wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben [26]. Kurz gesagt wurden /Well in 96-Well-Platten ausgesät, Zellen mit einer Dichte von 5 x 10 3 Zellen. Zu den Zeitpunkten 1, 3 und 5 Tagen wurde die CCK-8-Assay durch Zugabe von 10 ul der CCK-8-Lösung (Dojindo Molecular Technologies, Inc. Japan) in jede Vertiefung und Inkubation für 1,5 h durchgeführt nach dem Protokoll des Herstellers. Die Absorption wurde bei λ = 450 nm auf einem Plattenlesegerät gemessen. Die Ergebnisse wurden als die Absorption jeder experimentellen gut minus dem Wert der optischen Dichte von leeren Brunnen unter Beweis gestellt. Alle Proben wurden in dreifacher Ausführung mit drei unabhängigen Experimenten wiederholt.
Alkalische Phosphatase-Aktivität
alkalische Phosphatase-Aktivität kolorimetrisch alkalische Phosphatase-Assay-Kits (Nanjing Jiancheng Bioengineering Insitute) verwendet wurde analysiert und ein Ausgangs Einsaatdichte von 50'000 Zellen pro 24 unter Verwendung von dish wie zuvor beschrieben [27, 28]. Zum Zeitpunkt von sieben und 14 Tagen wurden die Zellen dreimal mit PBS und 0,1% Triton X-100 solubilisiert (gepuffert in 0,1 mol /l PBS, pH 7,3) bei 4 ° C für 1 h. Nach der Beschallung und Zentrifugation wurde ALP-Aktivität im Überstand kolorimetrisch Ablesungen OD405 /OD562 unter Verwendung bestimmt. Gesamtprotein wurde durch BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Inc.) quantifiziert. Die ALP-Aktivität wurde mit dem Gesamtprotein normalisiert. Proben wurden durchgeführt, in dreifacher Ausführung mit drei unabhängigen Experimenten ausgeführt.
Real-time PCR
MC3T3-E1-Zellen mit einer Dichte von 2 × 10 5 und kultiviert für 14 Tage ausgesät wurden wie zuvor beschrieben [26, 28 , 29]. Die Wirkungen von rhBMP2_108 bei verschiedenen Konzentrationen wurden auf vier osteogenen bezogenen Genexpression einschließlich alkalischer Phosphatase (ALP) untersucht, Kollagen I (COL I), Runt-bezogenen Transkriptionsfaktor zwei (Runx 2) und Osteocalcin (OCN). Gesamt-RNA wurde aus MC3T3-E1-Zellen durch Trizol-Reagenz (Tripure Isolation Reagent, Roche Applied Science, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die Konzentration und die Qualität der Gesamt-RNA-Proben wurde durch Nanodrop (Thermo Fisher Scientific Inc.) analysiert. Komplementäre DNA wurde aus 2 ug Gesamt-RNA synthetisiert unter Verwendung RevertAidTm First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) nach dem Protokoll des Herstellers. RT-qPCR wurde in 20 & mgr; l Reaktionen, die 10 & mgr; l SYBR Green Master Mix (Roche Applied Science, Deutschland), 0,6 & mgr; l (10 & mgr; M) von jeder Vorwärts- und Rückwärts-Primer für jedes Gen von Interesse, 2 ul cDNA-Matrize und 6,8 & mgr; l durchgeführt Wasser. Die Primersequenzen (gezeigt in Tabelle 1) wurden nach dem Referenz entwickelt. Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), ein Referenz-Gen wurde als Kontrolle verwendet. Die Reaktion wurde unter Verwendung eines ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) analysiert, und die PCR-Amplifikation Lauf für 40 Zyklen. Zur Validierung wurde spezifische Amplikon Verstärkung ohne genomische DNA-Kontamination, Schmelzkurvenanalyse durchgeführt und die einzige Spitze erschien um die Temper-Temperatur. Relative Expressionsniveaus für jedes gewünschte Gen wurden normalisiert gegen den Ct-Wert von GAPDH und bestimmt durch die Delta-Ct-Methode. Alle Proben wurden in dreifacher Ausführung für drei unabhängige studies.Table 1 Primer-Sequenzen für die Differenzierung der Osteoblasten-Marker
GAPDH F
GTGAAGGTCGGTGTGAACGG bestimmt
GAPDH R
TCCTGGAAGATGGTGATGGG
OPN F
GAGGAAACCAGCCAAGGTAAG
OPN R
AAAGCAAATCACTGCCAATCTC
OCN F
GAGGACCATCTTTCTGCTCACT
OCN R
CGGAGTCTGTTCACTACCTTATTG
ALP F
TGTGGAATACGAACTGGATGAG
ALP R
ATAGTGGGAATGCTTGTGTCTG
RUNX2 F
GTGTTCCCTACTCAGCCGTC
RUNX2 R
GAGGCCTCGGTCCACATTAG
Alizarinrot Quantifizierung
Alizarin-rot-Färbung wurde durchgeführt, um die Anwesenheit von extrazellulären Matrix-Mineralisierung nach 14 Tagen zu bestimmen. MC3T3-E1-Zellen wurden in einer Dichte von 50.000 Zellen pro 24-Well-Kulturschale, die verschiedenen Konzentrationen von rhBMP2_108 enthält. Nach 14 Tagen in 96% Ethanol wurden die Zellen für 15 min fixiert und mit 2% Alizarinrot-Lösung in Wasser (pH 4,2) bei Raumtemperatur für 1 h und visualisiert unter Lichtmikroskopie gefärbt. Danach wurde Alizarinrot Quantifizierungs 200 ul 1% Cetylpyridiniumchlorid gelöst unter Verwendung von bei Raumtemperatur für 4 h (mit doppelt destilliertem Wasser gelöst). Dann wurden 100 ul Lösung auf 96-Well-Platte übertragen OD 560.
Statistische Analyse Text
Alle Analysedaten durchgeführt wurde GraphPad Prism6.0 Software. Normalverteilung der Probendaten wurden für die vorliegende Studie angenommen und deshalb parametrischer Test wurde Einweg-ANOVA analysiert und statistisch signifikante Werte wurden als p
& lt angenommen; 0,05. Mittelwert und Standardfehler (SE) wurden analysiert unter Verwendung von Einweg-ANOVA mit einer Post-hoc-Test mit Tukey-Analyse.
Ergebnisse | Wirkung von rhBMP2_108 auf Zellrekrutierung
Um die Auswirkungen von rhBMP2_108 auf Zellrekrutierung zu untersuchen wurde eine Transwell-Kammer bei fünf verschiedenen Konzentrationen von rhBMP2_108 (Fig. 1) verwendet. Es wurde festgestellt, dass nach einer 24-h-Zeitraum, alle Konzentrationen von rhBMP2_108 und Kontroll rhBMP2 Lage waren signifikant Zellrekrutierung von MC3T3-E1-Zellen, wenn mit Kontrollproben verglichen zu erhöhen. Wenig Variabilität zwischen den Proben wurde ein starkes Potenzial demonstrieren für alle Konzentrationen von rhBMP2_108 beobachteten Zellrekrutierung zu induzieren (Abb. 1). Feige. 1 Zellrekrutierung Test zeigte, dass alle Konzentrationen von rhBMP2_108 signifikant konnten MC3T3-E1-Zellrekrutierung zu verbessern, wenn im Vergleich zu Kontrollproben ohne rhBMP2 (Maßstabsbalken = 100 & mgr; m). Alle Experimente wurden in dreifacher Ausführung mit drei unabhängigen Experimenten (n
= 9) durchgeführt. Die Daten stellen Mittel +/- SEM. ** Bezeichnet alle Proben deutlich höher als die Kontrollproben, p
& lt; 0,01)
Wirkung von rhBMP2 auf die Zellproliferation
Die Wirkung von rhBMP2_108 bei fünf Konzentrationen untersucht und zu steuern rhBMP2 auf ihre Fähigkeit, die Zellproliferation in vitro (Fig. 2) zu stimulieren. Es wurde festgestellt, dass MC3T3-E1-Zellen nach Animpfen sehr ähnliche Zellzahl 1 Tag zeigten unabhängig von Zellkulturmedien Konzentration von rhBMP2_108 (Fig. 2). Ein leichter Anstieg der Zellzahl nach 3 Tagen beobachtet wurde, konnte jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen den verschiedenen Behandlungsarten beobachtet werden (Fig. 2). Um 5 Tage nach der Aussaat wurde eine signifikante Zunahme der Zellzahl beobachtet für MC3T3-E1-Zellen mit allen Konzentrationen von rhBMP2_108 in dieser Studie verwendet wurden (Fig. 2). Interessanterweise konnten keine Vorteile für höhere Konzentrationen von rhBMP2_108 gefunden werden, wenn im Vergleich zu ihren Pendants unteren (Fig. 2). Feige. 2 Die Zellzahl berechnet durch einen CCK-8 Assay für MC3T3-E1-Zellen bei verschiedenen Konzentrationen von rhBMP2_108 ausgesät im Vergleich zu Gewebekultur-Kunststoffsteuerung (Alle Experimente wurden in dreifacher Ausführung mit drei unabhängigen Experimenten durchgeführt (n
= 9). Daten Kontrollproben signifikant niedriger als alle anderen Behandlungsmodalitäten, p
& lt stellt Mittel +/- SEM # bezeichnet;. 0,05)
Wirkung von rhBMP2 auf die Zelldifferenzierung
RhBMP2_108 dann für seine Fähigkeit, Osteoblasten zu beschleunigen beurteilt Differenzierung in verschiedenen Konzentrationen (Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5, Fig. 6). Zunächst wurde festgestellt, dass rhBMP2_108 konnte deutlich ALP-Aktivität bei sieben und 14 Tage nach der Aussaat für alle Konzentrationen von rhBMP2_108 (Abb. 3) zu erhöhen. Interessanterweise war es bei 7 Tagen beobachtet, dass ALP-Aktivität bei rhBMP2_108 Konzentrationen von 50, 100 und 200 ng /ml war signifikant höher im Vergleich zu Kontrollproben (Fig. 3). Nach 14 Tagen empfangen alle Modalitäten Behandlung rhBMP2_108 bei verschiedenen Konzentrationen zeigten eine deutliche 16-fache Steigerung der Aktivität ALP im Vergleich zu Kontrollproben frei von rhBMP2_108 (Abb. 3). Feige. 3 ALP-Aktivität wurde für Proben, die bei sieben und 14 Tage nach der Aussaat mit signifikant erhöht rhBMP2_108 ausgesät im Vergleich zu Gewebekulturkunststoff Kontrolle allein (Alle Experimente wurden in dreifacher Ausführung mit drei unabhängigen Experimenten durchgeführt (n
= 9). Die Daten stellen Mittel + . 0,05;; ** bezeichnet deutlich höher als alle anderen Modalitäten, S.
& lt; 0,05, bezeichnet # Kontrollproben - /SEM * signifikanter Unterschied zwischen 500 ng /ml und 10 ng /ml rhBMP2, S.
& lt bezeichnet deutlich niedriger als bei allen anderen Behandlungsmodalitäten, p
& lt; 0,05)
Abb. 4-mRNA-Spiegel von (a) ALP, (b) OCN, (c) COL-1 und (d) Runx2 für MC3T3-E1-Zellen bei verschiedenen Konzentrationen von rhBMP2_108 ausgesät (Alle Versuche wurden in dreifacher Ausführung mit drei unabhängigen Experimenten durchgeführt (n < . br> = 9) Die Daten stellt Mittel +/- SEM * p & lt
bezeichnet;. 0,05; ** als alle anderen Modalitäten deutlich höher bezeichnet, p
& lt; 0,05, bezeichnet # Kontrollproben signifikant niedriger als bei allen andere Behandlungsmodalitäten, p
& lt; 0,05)
Abb. 5 Qualitative Analyse von Alizarin-Rot-Färbung demonstrierte 14 Tage nach der Aussaat
Abb Mineralisierung für MC3T3-E1-Zellen bei steigenden Konzentrationen von rhBMP2_108 erhöht. 6 Quantitative Analyse von Alizarin-Rot-Färbung. rhBMP2_108 zeigen eine konzentrationsabhängige Zunahme der Alizarin-Rot-Färbung (Alle Versuche wurden in dreifacher Ausführung mit drei unabhängigen Experimenten durchgeführt (n
= 9). Die Daten stellen Mittel +/- SEM. * bedeutet signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen, p
& lt; 0,05; ** bezeichnet deutlich höher als alle anderen Modalitäten, S.
& lt; 0,05, bezeichnet # Kontrollproben signifikant niedriger als alle anderen Behandlungsmodalitäten, p
& lt; 0,05)
Dann MC3T3-E1-Zellen für Gene, die für ALP, OCN, COL-1 und Runx2 bei verschiedenen Konzentrationen von rhBMP2_108 (Fig. 4) wurden für die mRNA-Spiegel durch Echtzeit-PCR untersucht. Für codierende Gen Runx2, bis zu einer fünffachen Anstieg wurde bei einer Konzentration von 500 ng beobachtet /ml im Vergleich zu Kontrollproben mit einem deutlichen Anstieg bei 100 und 200 ng /ml im Vergleich zu niedrigeren Konzentrationen (Fig. 4a). Ebenso COL-1 auch abhängig Erhöhung der Genexpression gezeigt Konzentration (Fig. 4b). Hier jedoch nur bis zu einem zweifachen Anstieg wurde beobachtet relativen Proben zu steuern (Fig. 4b). Es wurde festgestellt, dass mRNA-Spiegel von ALP waren mehr als das Fünffache bei 14 Tagen bei Konzentrationen von zehn und 50 ng erhöht /ml rhBMP2_108 wohingegen bei einer Konzentration von 100 und 200 ng /ml 20-fache Steigerung der ALP-Aktivität (Fig. 4c). Die höchste Konzentration von 500 ng /ml zeigte eine 40-fache Erhöhung der Aktivität, wenn ALP zu Kulturmedien im Vergleich ohne rhBMP2 (Fig. 4c). Die größte fache Veränderung der OCN Ebenen beobachtet wurde, wo bis zu 300-fachen Anstieg wurde beobachtet, wenn im Vergleich zu ihren jeweiligen Steuer ohne rhBMP2 (Abb. 4d).
Schließlich wurde Alizarin-Rot-Färbung verwendet, um in vitro-Mineralisierung (Abb visualisieren. 5). Es wurde beobachtet, daß ohne rhBMP2, MC3T3-E1 Präosteoblasten jede visuelle Mineralisierung von Alizarin-Rot-Färbung (Fig. 5), die beobachtet wird zu erzeugen konnten. Die Auswirkungen der rhBMP2_108 eine signifikante konzentrationsabhängige Zunahme der Alizarin-Rot-Färbung 14 Tage nach der Aussaat (Abb. 6) unter Beweis gestellt.
Diskussion
Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Bioaktivität von einer kürzeren rekombinanten BMP-2 (rhBMP2_108 zu untersuchen ) Sequenz auf Osteoblasten Verhalten. Die Verwendung von rhBMP2 für orthopädische und dentale Behandlungen wurde für eine Reihe von Verfahren, einschließlich offenen Frakturen, Hüfte rekonstruktive Operationen sowie geführte Knochenregeneration in der Zahnmedizin [30-33] verwendet. Trotz in vivo-Ergebnisse vielversprechend demonstriert hat, Wachstumsfaktor-Einsatz eine Mischung aus Erfolg hatte, als für die klinische Anwendung genutzt werden. Einige der wichtigsten Anliegen in Bezug auf Wachstumsfaktor Auslastung erhöht ist ihre vorübergehende Bioaktivität, die konnte vorgeschlagen wurde in der Größenordnung von Minuten bis Stunden [18] zu sein.
Drei Hauptbereiche der Forschung auf die Verbesserung der Bioaktivität gerichtet sind von Wachstumsfaktoren; 1) unter Verwendung der Gentherapie, 2) die Proteinstabilität zu verbessern oder 3) Verbesserung des Wachstumsfaktor-Delivery-System. Ein Verfahren, das für die Wachstumsfaktor-Liefer früh als vielversprechend erwiesen hat, ist, dass der Gentherapie, wo die Verwendung von viralen Vektoren, wie Adenovirus, können viele der Einschränkungen der Proteinabgabe umgehen, indem sie eine hohe in vivo Transduktionseffizienz mit relativ kurzer Expressionszeit aufweisen [34 -38]. Ihr Hauptvorteil ist die überexprimierte Protein innerhalb der Organismen Hauptzelle aufgebaut ist, und hat somit Zugriff auf eine Vielzahl von Faltungs Proteine mit einer Dosiergenauigkeit Verpacken und Liefern Wachstumsfaktoren an ihre umgebenden Gewebe [25, 39, 40]. Trotz der Fortschritte in diesem Bereich der Forschung gemacht wird, wird die Anwendung der Gentherapie verboten noch durch die FDA ihre zukünftigen klinischen Einsatz im Moment eine Zukunft optimistisch Ansatz ohne bekannte Zeitplan für seine eventuelle Gebrauch. Darüber hinaus haben die Knochenregeneration jüngsten Strategien kurze synthetische BMP2 ähnliche Peptide unter Verwendung gezeigt, zu erleichtern [41-44], aber einen Mangel an klinischen Berichte solche Strategien nutzen immer noch fehlt.
So wird es von entscheidender Bedeutung, alternative Methoden zu finden, die möglicherweise als geeignet für die Verbesserung der Wachstumsfaktor Bioaktivität werden. In der vorliegenden Studie wurde eine neuartige rekombinante Version von BMP2 (rhBMP2_108) mit einer kürzeren Aminosäuresequenz. Vor der Tierversuche jedoch in vitro Tests wurden auf die Zellaktivität durchgeführt. Es wurde in der vorliegenden Studie fand heraus, dass rhBMP2_108 r war zunächst der Lage, die Rekrutierung von Vorläuferzellen gezielt durch frühe und schnelle Rekrutierung von Zellen innerhalb von 24 h (Abb. 1) begünstigt wird. Das Homing von Progenitorzellen und Stammzellen ist eine der wichtigsten Anfangsphase in der frühen Beginn der Bruchreparatur und ist eine notwendige Komponente der Wundheilung von Knochendefekten. Als solches ist die Möglichkeit für rhBMP2_108 die Rate und die Anzahl der Vorläuferzellen zu Defekten Seiten zu beschleunigen entscheidend für die Knochenreparatur.
Obwohl als die Wirkungen in der vorliegenden Studie gezeigt ersichtlich, dass rhBMP2_108 signifikant konnte die Zellproliferation zu induzieren, es nicht in einer konzentrationsabhängigen Weise beobachtet. Dies kann auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass Zellen, die Zelldifferenzierung unterzogen werden gleichzeitig nicht anfällig zu vermehren. Obwohl nicht viel Konzentration abhängige Beobachtungen für die Rekrutierung von Zellen oder Proliferation gefunden wurden, wurden signifikante Unterschiede für die Differenzierung von Osteoblasten in Reaktion auf rhBMP2_108 gefunden. Es wurde über eine vierfache Steigerung der ALP-Aktivität beobachtet, dass mit rhBMP2_108 und eine weitere Konzentration abhängige Anstiege in Alizarin-Rot-Färbung nachgewiesen wurden unsere Hypothese bestätigt, dass rhBMP2_108 in erster Linie wirkt durch die Osteoblasten-Differenzierung zu stimulieren. Es wurde auch beobachtet, dass eine signifikante Zunahme der mRNA-Konzentrationen von ALP in einer konzentrationsabhängigen Weise beobachtet wurde. Interessanter OCN, ein spät für Osteoblasten Differenzierungsmarker etwa 300-fach hochreguliert wurde, wenn mit Kontrollproben (Abb. 4b) verglichen. Dieser Befund bedeutet wahrscheinlich, dass die MC3T3-E1 Präosteoblasten in Kontrollvertiefungen ohne ausgesät rhBMP2 wahrscheinlich Vorläuferzellen blieb und nicht in Richtung der Osteoblasten-Linie im Verlauf dieser Versuche unterscheiden. Dies wird weiter durch die Tatsache offensichtlich, daß die Proben ohne rhBMP2 in den Alizarinrot Experimenten (Fig. 5) keine Mineralisierungspotential zeigten.
Obwohl die Ergebnisse der vorliegenden Studie die Auswirkungen dieser kürzeren Aminosäuresequenz von rhBMP2_108 auf Zelle bestätigen Aktivität, viel Forschung nach wie vor notwendig, um diese Ergebnisse in einem Tiermodell vor der klinischen Erprobung zu validieren. Es bleibt so gut wie unbekannt, wenn die Proteinaktivität wird in vivo durch die verkürzte Aminosäuresequenz und viel zukünftige Forschung Untersuchung dieser Beziehung sowohl in Bezug auf Proteinhalbwertszeit sowie ihre späteren Auswirkungen auf die Knochenbildung beeinflusst werden sorgfältig ausgewertet werden müssen. Darüber hinaus derzeit ihren Vergleich zu führenden rhBMP2 mit FDA-Zulassung auf dem Markt erhältlich ist auch notwendig, um ein besseres Verständnis über die Auswirkungen von Protein Aminosäure Länge auf Bioaktivität von rekombinanten Proteinen zur Verfügung zu stellen.
Schlussfolgerung, Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen, dass eine kürzere Aminosäuresequenz des rekombinanten BMP2 (rhBMP2_108), wenn sie im Handel erhältlich rhBMP2 in vitro verglichen bioaktiven Eigenschaften von BMP2 beibehält. Es wurde gezeigt, dass rhBMP2_108 konnte schnelle Zell Rekrutierung von MC3T3-E1 Präosteoblasten und deren Differenzierung in einer konzentrationsabhängigen Weise in Richtung der Osteoblasten-Linie unterstützen zu stimulieren. Zukunft in vivo Forschung Verwendung dieser Aminosäuresequenz von rhBMP2_108 Analyse ist nun notwendig, bei kritisch großen Knochendefekten. Des Weiteren Untersuchung über die optimale Liefersystem sind diese Wachstumsfaktor erforderlich, um potenziell weiter seine Bioaktivität für die klinische Anwendung zu verbessern
Abkürzungen
rhBMP2.
Rekombinanten morphogenetischen Knochenprotein 2
rhBMP2_108:
Short polypetitde Kette von 108 Aminosäuren für die rekombinanten morphogenetischen Knochenproteine zwei
ALP:
alkalische Phosphatase
OCN:
Osteocalcin
COL-1:
Kollagen 1
Runx2:
runt- related transcription factor zwei
GAPDH:
Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
FDA:
Food and Drug Administration
CHO:
Chinese Hamster Ovary
PCR: Polymerase-Kettenreaktion
PBS :
Phosphat-gepufferte Lösung
HCl:
Salzsäure
EDTA:
Äthylendiamintetraessigsäure
NaCl:
Natriumchlorid
DMEM:
modifizierten Dulbeccos eagle-Medium
BCA:
Bicinchoninsäure
OD:
pptical Dichte
SE:
Standardfehler
Erklärungen
Danksagung
dieses Projekt wird von Programm für New Century Ausgezeichnete Talente in University (NCET-11-0414), Excellent Youth Foundation von Hubei und den Mitteln der National Natural Science Foundation of China (81271108) unterstützt wurde.
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