Abstrakt
Hintergrund
die genotypische Vielfalt und Kariogenizität von C. albicans
aus dem Zahnbelag von Kindern sind schlecht verstanden. Diese Studie soll die genotypische Vielfalt und Kariogenizität von C. albicans zu erkunden
von Kindern mit frühkindlicher Karies und kariesfreien Kinder.
Methoden
Zahnplaqueproben von 238 Kindern mit frühkindlicher Karies und von 125 Karies -freie Kinder wurden für C. albicans
Isolation gesammelt. Ein PCR-Verfahren, basierend auf 25S rDNA verwendet wurde C. albicans
Genotypen und die Stämme mit verschiedenen Genotypen zu analysieren wurden hinsichtlich acidogenicity und aciduricity getestet.
Ergebnisse
Among 129 C. albicans Isolate
, 79 (61,2%) gehörten die Verteilungshäufigkeit von Genotypen A und C oder Genotypen B und C keinen signifikanten Unterschied zwischen den Kindern mit frühkindlicher Karies und kariesfreien Kinder (p = 0,178
und 0.148) auf Genotyp A. zeigte, während Genotypen A und B zeigten signifikant unterschiedliche Verteilungen (p = 0,010
). Keine signifikanten Unterschiede in aciduricity wurden unter den drei Genotypen gefunden, aber die acidogenicity von Genotypen B und C unterschieden sich signifikant von dem Genotyp A bei pH 4,0.
Schlussfolgerungen
Die genotypische Verteilung von C. albicans
verbunden ist mit der Karieserfahrung von Kindern und dem Genotyp kann 4,0 bis seine acidogenicity bei pH bezogen werden.
Schlüsselwörter Candida albicans
kariogene Wirkung Frühkindliche Karies Genotype Rongmin Qiu und Wenqing Li zu dieser Arbeit beigetragen gleichermaßen.
Hintergrund Frühe Kindheit Karies (ECC) wird als das Vorhandensein von 1 oder mehr verfallene Zähne (noncavitated oder kavitierter Läsionen), fehlende Zähne (aufgrund von Karies) oder gefüllten Zahnflächen in jeder primären Zahn bei einem Kind 71 Monate definiert alt oder jünger sind [1]. Aufgrund der hohen Prävalenz in Grundschulkinder, ist ECC ein Problem der öffentlichen Gesundheit von großer Bedeutung. Weil caries durch Mikroorganismen im Zahnbelag hervorgerufen werden, das Wissen über die Beziehung zwischen den Mikroorganismen in der Kinderzahnbelags und ECC ist wichtig für die ECC-Prävention.
C. albicans
oft bei Kindern mit Karies detektiert wird, während dieser Hefe typischerweise abwesend in kariesfreien Kinder ist [2, 3]. Diese Ergebnisse liefern indirekte Beweise für die Beteiligung von C. albicans
mit Karies. In unserer früheren Studie, die Häufigkeit von C. albicans
im Zahnbelag von den Kindern getrennt mit ECC bestätigt wurde, dass höher zu sein als in kariesfrei (CF) Kinder (44,1 vs. 19,2%, χ
2 = 22,213, p & lt;.
0,001), die die C. albicans angegeben
ECC verwandt ist [4] Einige Berichte, die genotypische Verteilung von C. albicans analysiert
der zahnärztliche Biofilm von Grundschulkindern mit unterschiedlichen Kariesstatus und festgestellt, dass ein bestimmter Genotyp im dentalen Biofilm von Kindern mit schwerer frühkindlicher Karies (S-ECC) dominant war [5, 6]. Jedoch sind die Korrelationen zwischen den verschiedenen C. albicans
Genotypen und Kariogenität dieser Hefe vor unbekannt.
Forscher haben festgestellt, dass die Virulenzfaktoren von C. albicans,
wie Invasivität und drug resistance, sind verbunden mit der Genotyp [7-9] und dass acidogenicity und aciduricity sind wichtig C. albicans
Virulenzfaktoren für Karies. In unserer früheren Studie, die Stämme von C. albicans
aus dem Zahnbelag von ECC Kinder getrennt wurden gefunden Stämme zu sein aciduric als Kinder diejenigen, die aus CF, was darauf hinweist, dass die aciduricity klinischer C. albicans
mit einem verbunden ist Kinderzahnstatus. Im Gegensatz dazu wurden keine Unterschiede bezüglich acidogenicity zwischen den beiden Gruppen [10] zu finden. Unabhängig davon bleiben die Beziehungen von acidogenicity und aciduricity mit Genotyp unklar. In dieser Studie
die Hypothese aufgestellt, dass die genotypische Verteilung von C. albicans
von ECC und CF Kinder unterscheidet und dass verschiedene C. albicans
Genotypen zeigen Variable acidogenicity und aciduricity. Um diese Hypothese zu testen,
C. albicans von der Zahnplaque von ECC und CF Kindern wurde von 25S rDNA-basierten PCR nachgewiesen und die acidogenicity und aciduricity von verschiedenen C. albicans
Genotypen bewertet.
Methods
Themen insgesamt
, 363 Kinder 3-5 Jahren (Mittelwert ± SD, 3,2 ± 1,9) wurden von vier Kindergärten in Guangzhou, China, von Februar bis April 2009 (200 Jungen und 163 Mädchen zufällig rekrutiert ). Die Kinder waren gesund und hatten keine Geschichte der Antibiotika-Einsatz für mindestens 1 Monat vor der Studie, und keiner ihrer bleibenden Zähne hatte noch ausgebrochen. Die Kinder wurden mit einer von zwei Gruppen zugeordnet entsprechend ihrer caries Status: Der ECC-Gruppe (n
= 238) oder die CF-Gruppe (n
= 125). Die diagnostischen Kriterien für ECC in dieser Studie verwendet wurden von Drury et al vorgeschlagen. [1]. Die Eltern der Kinder wurden schriftlich und eine schriftliche Einverständniserklärung zur Teilnahme umfassend informiert wurde von den Eltern erhalten, die die Teilnahme an der Studie teilzunehmen entschieden.
Zulassung wurde von der Forschungsethikkommission der Sun Yat-sen-Universität erhalten vor Beginn der Studie .
Probensammlung
Probensammlung wurde für 2 Stunden vor der Probennahme nicht zu essen am Morgen, und die Kinder gebeten wurden durchgeführt. Sterilisierte Zahn Entdecker wurden für Zahnbelag Sammlung verwendet. Für die ECC Kinder wurde von Zahnbelag von Kariesläsionen in den Frontzähnen und /oder Molaren erhalten und dann vereinigt. Für die CF Kinder, gepoolt Zahnbelag wurde aus den Schall Labialflächen oberen Frontzähne und aus den Schall bukkalen Oberflächen der oberen und unteren ersten Milchmolaren erhalten. Alle Proben wurden einzeln in sterilen Röhrchen, die Hirn-Herz-Infusionsbrühe (HKM Co., Guangdong, China) und auf Eis gelagert gehalten; wurden die Proben an das Labor innerhalb von 2 h nach der Entnahme transportiert.
C. albicans
Isolierung und Identifizierung
Alle Proben durch Vortexen für 30 s keine Hefe-Aggregate zu dispergieren, dispergiert waren. Eine 20-ml-Aliquot jeder Probe wurde auf eine Platte geimpft, das Selektivmedium (CHROMagar Candida; CAC, CHROMagar Co., Paris, Frankreich) und dann für 48 h bei 37 ° C [11]. Um so viele Vertreter Genotypen von C. albicans erhalten wie praktisch möglich in einer Probe
wählten wir 5 koloniebildende Einheiten (KBE) pro Probe (ca. 30-300 CFUs pro Kind) von jeder CAC Platte unter Verwendung eines Verfahrens beschrieben, zuvor [12] Selektionsbias zu minimieren und die Zufälligkeit zu maximieren. Alle Kolonien in jeder Probe wurden auf Sabouraud-Dextrose-Brühe (SDB) (HKM Co., Guangdong, China) mit Glycerin (30% v/v
) und bei -80 ° C aufbewahrt., Die Methoden der Thema Rekrutierung, die Probenentnahme sowie C. albicans
Isolierung und Identifizierung wurden in unserer früher veröffentlichten Studie [4] beschrieben. Die Isolate von C. albicans
die gespeichert wurden Isolate aus der früheren Studie [4].
DNA-Extraktion
Ein Kochmethode zur DNA-Extraktion verwendet wurde. Gefrorene Suspensionen von C. albicans
Stämme wurden gemischt, und eine 200-ul-Aliquot jeder Probe Suspension wurde in ein Eppendorf-Röhrchen und zentrifugiert für 8 min bei 12.000 rpm zugegeben. Nachdem der Niederschlag in flüssigem Stickstoff gemahlen wurde, wurde es für 5 min, nachdem der flüssige Stickstoff verdampft war stehen gelassen; Dieses Verfahren wurde dreimal wiederholt. Der Niederschlag wurde für 10 min in 30 ul DNA-Extraktionslösung, gekocht bei 100 ° C suspendiert und bei 12.000 rpm für 3 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde bei -20 ° C bis zur PCR-Amplifikation gespeichert.
PCR-Amplifikation
Die Primer CA-INT- L (5'-ATAAGGGAAGTCGGCAAAATAGATCCGTAA-3 ') und CA-INT-R (5'-CCTTGGCTGTGGTTTCGCTAGATAGTAGAT-3 "wurden) entwickelt, wie zuvor beschrieben [13]. Die Verstärkungsmischung (Gesamtvolumen 50 ul) enthielt 10 ul PCR-Puffer; 1 & mgr; l jeweils von dNTPs, Primer und Taq-Polymerase (Promega, Madison, WI, USA); 34 & mgr; l ddH 2 O; und 2 & mgr; l der Matrizen-DNA. Die Amplifikationsbedingungen waren wie folgt: anfängliche Denaturierung bei 93 ° C für 5 min, 40 Zyklen Denaturierung bei 93 ° C für 30 s, Primer-Annealing bei 55 ° C für 45 s und Verlängerung bei 72 ° C für 45 s, mit eine letzte Verlängerung bei 72 ° C für 7 min. Zur Identifizierung wurden die PCR-Produkte geladen auf 2% Agarose-Gelen (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) bei 100 V für 30 min und anschließend mit einer Ethidiumbromidlösung gefärbt. Die C. albicans
Sequenzen wurden in fünf Genotypen klassifiziert nach der Bandenmuster: Genotyp A (450 bp), Genotyp B (840 bp), Genotyp C (450 und 840 bp), Genotyp D (1080 bp), und Genotyp E (1400 bp) [14, 15].
Suspension Vorbereitung
Zwanzig Stämmen jeder C. albicans
Genotyp wurden für die Säureproduktion und Säuretoleranz untersucht. Gefrorene Vorräte der Stämme wurden in SDB und gezüchtet bei 37 ° C unter Schütteln (150 rpm) unter aeroben Bedingungen beimpft. Nachdem die Hefezellen für 17-24 h kultiviert wurden, wurden sie in der späten exponentiellen Wachstumsphase [16] und zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, enthaltend 0,05 mM Na 2HPO 4 /KH geerntet < sub> 2PO 4, pH-Wert 6,8). Die Zellen wurden in PBS suspendiert und auf eine optische Dichte (OD) von 1,0 bei 540 nm (äquivalent zu 1 × 10 8 Zellen /ml) für die Säureproduktion und Säuretoleranztests. Der OD-Wert wurde ein Ultraviolett-Spektrometer nachgewiesen unter Verwendung von (752S, Lengguang Tech. Co., Shanghai, China).
Säureproduktion und Säuretoleranz Assays
Sterile SDB (enthaltend 100 mM Glucose) wurde für die Säureproduktion verwendet und Säuretoleranz-Tests; der pH-Wert des Mediums wurde auf verschiedenen anfänglichen pH-Werten von 7,0 eingestellt, 6,0, 5,5, 5,0, 4,5 und 4,0 (pH S-25, Shanghai Precision & amp; Scientific Instrument Co., China) unter Verwendung steriler 2 mM HCl oder 4 mM NaOH [17]. Kurz gesagt wurden 50-ul-Aliquots von Suspensionen von jedem der verschiedenen Genotypen bei einer OD 540 von 1,0 wurden für 8 min separat zu 5 ml SDB, kultiviert für 48 h bei 37 ° C und dann bei 4500 rpm zentrifugiert Rühren bei 4 ° C. Der pH-Wert des endgültigen Überstand wurde unter Verwendung eines Standard-pH-Meter detektiert Säurebildung zu bestimmen. Der & Dgr; pH (gleich dem anfänglichen pH-Wert minus dem Endwert pH) verwendet wurde, die Säureproduktion zu bewerten.
Um das Wachstum unter sauren Bedingungen zu bewerten, wurde der Niederschlag 3 mal in PBS gewaschen und dann mit 2 ml PBS verdünnt. Dann wurde die Trübung bei 540 nm (OD 540) unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen.
Diese Experimente wurden dreifach durchgeführt. Die mittlere ApH und OD 540 wurden jeweils berechnet aus drei Wiederholungsproben. Ein größerer ApH Wert zeigte eine größere Fähigkeit, Säure zu erzeugen, und eine größere OD 540 angegebenen Wert ein besseres Wachstum und eine höhere aciduricity.
Statistische Analyse
Die Datenanalyse wurde unter Verwendung von SPSS 16.0 (SPSS, Chicago, IL , USA). Die Beziehung zwischen der genotypische Vielfalt von C. albicans
und verschiedenen Karies Erfahrungen wurde Chi-Quadrat-Tests analysiert. Um Typ-I-Fehler zu vermeiden, wenn mehrere Gruppen über Chi-Quadrat-Tests, ein kritischer p-
wert erforderliche Korrektur angewandt wurde verglichen und die p-
Wertschwelle wurde auf 0,017 in Drei-Wege-Vergleiche gesetzt. Die Unterschiede in ApH und OD 540 Werte unter den drei Genotypen von C. albicans und Videos ANOVA analysiert. Wenn ein signifikanter Unterschied zwischen den drei Genotypen gefunden wurde, wurde die LSD-t
Methode verwendet, um die Differenz zwischen den beiden Gruppen zu analysieren und das Signifikanzniveau für die statistischen Tests wurde bei 0,05 festgelegt.
Ergebnisse
