Zusammenfassung
Hintergrund
Gingival Epithelzellen die Hauptpopulation des Gingivagewebe sind, handeln als Front-Verteidigungslinie gegen mikrobielle Eindringen und die Homöostase des parodontalen Gewebe in Gesundheit und Krankheit über NLR Familie pyrin domain-containing-3 (NLRP3) Inflammasoms Regulierung, die pathogen und Gefahren associated molecular patterns (PAMPs und Damps) erkennt . Das Ziel dieser Studie war es zu bestimmen, ob die Aktivierung von NLRP3 Inflammasoms auf Infektion mit dem Pathogen periodontal hängt
Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis
) oder Stimulation mit P. gingivalis
Lipopolysaccharid (LPS), und /oder extrazellulären Adenosintriphosphat (ATP).
Methoden
Eine Zelle orale epitheliale Linie mit P. gingivalis
, LPS und ATP P. gingivalis
behandelt wurde. Das Gen und Protein-Expression von NLRP3 Inflammasoms Komponenten wurden durch Echtzeit-RT-PCR und Immunoblots quantifiziert. Die Produktion von IL-1β und IL-18 mittels ELISA gemessen.
Ergebnisse
Es gab keine Erhöhung der NLRP3 Inflammasoms Genexpression nach P. gingivalis
Infektion, es sei denn durch ATP vorge stimuliert. Offensichtliche Erhöhungen von NLRP3 Inflammasoms Genexpression wurde nach P. gingivalis
LPS-Stimulation beobachtet, auch bei 2 durch ATP-stimulierte pre h.
Schlussfolgerungen
Die Ergebnisse zeigen, dass die Aktivierung von NLRP3 Inflammasoms verlässt sich nicht auf P . gingivalis
Infektion, wenn sie von P. gingivalis LPS stimuliert
und /oder extrazellulären ATP, was darauf hindeutet diverse Signalwege in der Wirtsimmunantwort beteiligt sind.
Schlüsselwörter extrazellulär Adenosintriphosphat (ATP) NLRP3 Inflammasoms Porphyromonas gingivalis
(P. gingivalis
) P. gingivalis
LPS Hintergrund
chronische Parodontitis, einer der häufigsten und weit verbreitete Krankheiten beim Menschen weltweit [1], als eine Infektion getriebene chronisch definiert ist entzündliche Erkrankung des Zahnhalte bei der Zerstörung von Zahnfleischgewebe, Absorption des Alveolarknochens resultierenden und schließlich Zahnverlust [2]. Wenn eine Infektion auftritt, wird das angeborene Immunsystem die erste Verteidigungslinie gegen Krankheitserreger und aktiviert das adaptive Immunsystem für eine nachhaltige Schutz vor solchen Invasionen [3]. Die intrazelluläre Multi-Protein-Komplexe
, als "NLR Inflammasome" bekannt spielen eine zentrale Rolle bei der angeborenen Immunität. Unter Inflammasome ist die pyrin domain-containing-3 (NLRP3) Inflammasoms die am meisten untersuchte [4]. Gingival epitheliale Zellen exprimieren ein funktionelles NLRP3 Inflammasoms, die durch pathogen oder Gefahr-associated molecular patterns (PAMPs oder Damps) [4] aktiviert werden kann. NLRP3 ist mit dem Adapter-Protein ASC (Apoptose-assoziierten Fleck-like protein) zu einem Multiproteinkomplex zusammengesetzt, die Caspase-1-Aktivierung und die anschließende Reifung der pro-inflammatorischer Zytokine Interleukin (IL) -1β und /oder IL-18 regelt in der Wirtsantwort auf periodontale Infektion [4]. Gingival Epithelzellen PAMPs oder Damps [5] durch Stimulation der Erreger Erkennungsrezeptoren (PRR) [1, 3], mit anschließender Freisetzung der proinflammatorischen Zytokine IL-1β und IL-18 [6] erfassen und zu erkennen. Die grundlegenden Arbeiten von Bostanci et al. [7] angegeben zunächst, dass NLR Inflammasome in Parodontitis beteiligt sind, die Antworten auf P. gingivalis
Infektion sowohl klinische als auch in vitro
Studien.
Interleukin-1β (IL-1β), ein proinflammatorische Zytokin gehören, an den IL-1 Familie ist, kritisch in der Wirtsabwehr gegen mikrobielle Infektionen [5] und reguliert angeborenen Immun- und Entzündungsreaktionen. IL-18 ist ein weiteres proinflammatorisches Zytokin Zugehörigkeit zu der IL-1-Familie [6] und wurde vor kurzem als ein wichtiges Element in der Inflammasoms System beschrieben, das Caspase-1 aktiviert und führt zur Aktivierung des Entzündungsprozesses. Jüngste Erkenntnisse haben gezeigt, dass die Reifung und die Sekretion von IL-1β und IL-18 durch die NLRP3 Inflammasoms Komplex reguliert werden, welche die NLRP3 Gerüst enthält, Caspase-1 und apoptotischen speck Protein eine C-terminale Caspase Rekrutierungsdomäne (ASC), die [8 ]. Überschüssiges IL-1β und IL-18 tragen zu einer Erhöhung der Anzahl von menschlichen Entzündungsreaktionen [9]. Obwohl IL-1β und IL-18 auf die gleiche Zytokin-Familie gehören, deren Genexpression und Sekretion in menschlichen Monozyten-Zellen in Reaktion auf P. gingivalis
[10] differentiell reguliert. Daher Zytokine der IL-1-Familie über
verschiedene Wege in der komplexen Pathogenese von Periodontitis teilnehmen können [10].
P. gingivalis
, ein gram-negatives anaerobes Bakterium, [11], wurde bestätigt, eine vorherrschende parodontalen Erreger [12] und produziert eine Reihe von potentiellen Virulenzfaktoren zu sein, das Abwehrsystem [13] und induzieren eine entzündliche Reaktion in Parodontalerkrankungen [14] zu stören. Allerdings bleibt die Wirkung von P. gingivalis
bei Aktivierung des NLRP3 Inflammasoms umstritten. Lipopolysaccharide (LPS), da die Hauptzellwandkomponente von P. gingivalis
[15], der als ein wichtiger Faktor der Virulenz Hervorrufen der Entzündungsreaktion in der periodontalen Erkrankung [16]. Es scheint, einstimmig zu sein vereinbart, dass LPS-Behandlung von einkernigen Phagozyten, [17] Makrophagen [18] und oralen Epithelzellen [19] induziert signifikant die Expression von NLRP3 und procaspase-1 sowohl auf der mRNA und Protein-Ebene. Studien haben gezeigt, dass jede funktionelle Polymorphismus in LPS-Rezeptoren den Entzündungsprozess, und die klinischen Ergebnisse der periodontalen Krankheit betrifft [20]. Die Ergebnisse oben skizzierten legen nahe, dass ganze P. gingivalis
und P. gingivalis
LPS verschiedene Effekte auf die Aktivierung von NLRP3 Inflammasoms System haben können.
Extrazelluläre ATP (Adenosintriphosphat), einer der ersten Aktivatoren beschrieben NLRP3 Inflammasoms Bildung induzieren, wird zur Gruppe der endogenen Damps durch sterben oder verletzt Zellen freizugeschrieben [21, 22]. Seine Anwesenheit ist in gesunden Geweben zu vernachlässigen, kann aber zu hohe Mikromol Spiegel nach Gewebeschäden an entzündeten Stellen [23] steigen. Studien haben ATP induzierte Caspase-1-Aktivierung und anschließende Freisetzung von IL-1β gezeigt [24, 25]. Weiterhin Özlem et al. gezeigt, dass IL-1β in P. gingivalis nicht, es sei denn LPS behandelten oder infizierten gingivalen Epithelzellen (GECS) wurden anschließend mit ATP stimuliert, und das ATP hatte keinen zusätzlichen Effekt auf NLRP3 oder ASC Ausdruck
GECS infiziert abgesondert wurde [26] . Diese Ergebnisse weisen auf die Notwendigkeit, die Rolle von ATP in NLRP3 Inflammasoms Aktivierung bewerten.
Daher die Aktivierung des NLRP3 Inflammasoms Komplex in einer kultivierten oralen epithelialen Zellmodell von P. gingivalis
Infektion oder P. gingivalis
LPS oder ATP-Stimulation wurde getestet. Dies lieferte weitere Verständnis des Mechanismus hinter parodontalen Entzündung.
Methods
Oral epitheliale Zellkultur
die epitheliale Zelllinie (H413) aus einer humanen oralen Plattenepithelkarzinomen abgeleitet [27], geschichtete epithelialen Zellmorphologie zeigt in Kultur. H413 klonierten Zelllinien wurden unter Verwendung eines Grenzverdünnungsmethode etabliert, wie zuvor beschrieben [28]. Die klonierten Zellen wurden in Eagle-Minimum Essential Medium (JMEM, Joklik Modifikation, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), Penicillin /Streptomycin (100 IU /ml, Sigma) und 10% fötalem Kälberserum (FCS, CSL Limited , Victoria, Australien) bei 37 ° C in 5% CO
2 [29]. Die Kulturen wurden mit dreifacher express geerntet (Ersatz für Trypsin, Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) in PBS und subkultiviert alle 3 Tage.
Bakterielle Zellkultur
Porphyromonas gingivalis
(ATCC 33277) wurde für 24 h bei 37 ° C in einer Trypticase-Soja-Brühe, supplementiert mit Hämin (5 mg /ml, Sigma) und Menadion (1 mg /ml, Sigma) anaerob kultiviert. Am Tag der Zellbehandlung wurden Bakterien bei 5000 rpm zentrifugiert und 4 ° C für 15 min, zweimal gewaschen und resuspendiert in kaltem PBS, pH 7,3.
Zellverfahren
Konfluente H413-Zellkulturen (5 × 10 6 Zellen in T-25 cm 2 Kolben) mit P. gingivalis
bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 100 Bakterienzellen pro Epithelzelle dreimal mit PBS und infizierten gewaschen wurden [30 for] 2 und 4 h [31, 32] oder stimuliert mit 1 & mgr; g /ml ultrareinem Lipopolysaccharid (LPS) aus P. gingivalis
(Invivogen, San Diego, CA, USA) in die Zellwachstumsmedien für 2 und 4 h. Nicht infizierte und nicht-stimulierten Zellen dienten als Kontrollen.
Es wurden auch Experimente durchgeführt nach der Zellen mit 5 mM Adenosintriphosphat Vorinkubationsgefäß (ATP) (Invivogen) für 3 h vor der Infektion mit P. gingivalis in oder Stimulation mit P. gingivalis LPS
für 2 und 4 h. Zellen mit 5 mM ATP vorinkubiert 3 h als Kontrollen für diese Gruppen waren.
RNA Isolation und quantitative Echtzeit-RT-PCR
Nach der Behandlung wurden die Zellen in 1 ml Trizol-Reagens (Invitrogen) geerntet und RNA extrahiert gemäß dem Trizol-Protokoll. Für die reverse Transkription, die Erststrang-cDNAs wurden mit Oligo (dT) synthetisiert 12-18 (Invitrogen), 10 mM dNTP (Promega, Madison, WI, USA), 5 × ersten Gerüsts Puffer RNaseOUT ™ Recombinant RNase Inhibitor (Invitrogen) und Superscript ™ III Reverse Transcriptase (Invitrogen) entsprechend dem Protokoll des Herstellers.
Primer für Gene kodieren Inflammasoms Komponenten (NLRP3, ASC und Caspase-1) und der Zytokine IL-1β und IL-18 (Tabelle 1) mit Oligo Explorer-Software (1.1.0) und synthetisiert von Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, IA, USA) wurden entwickelt. Real-time RT-PCR-Analysen wurden von SYBR Green basierten Assays durchgeführt unter Verwendung des Stratagene MXpro-Mx3005P-System (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). PCR-Reaktionen wurden mit 2 & mgr; l der verdünnten cDNA-Proben, 200 nM von jedem entsprechenden geführt Vorwärts- und Rückwärts-Primer in einem 20 & mgr; l endgültige Reaktionsgemisch mit Platin SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen). cDNA-Proben isoliert aus nicht-manipulierten H413 Klon-1-Zellen wurden durch PicoGreen Kit (Invitrogen) quantifiziert und dann zur Konstruktion von Standardkurven (2-2000 pg) durch Bezugnahme auf die Expression des Haushaltsgen Codierung β-Actin verwendet. Die PCR-Reaktionen für jedes Gen wurden in dreifacher Ausfertigung in 96-Well-Platten durchgeführt und für 2 min, gefolgt von 40 PCR-Zyklen mit Denaturierung bei 95 ° C für 15 s, Annealing und Extension bei 60 ° bei 95 ° C durch Aktivierung initiiert C für 30 s. Die Ergebnisse wurden unter Verwendung von MXpro 4.10 software.Table 1 Grundierungen für Echtzeit-RT-PCR
Gene verwendet analysiert
Oligos
Primers5'-3 'Bei
erwartete Fragment Größe Bei
UniGene Zahlen
NLRP3
F-Primer
GCTGGACCTGAGTGACAAC
151 bp
Hs.159483
R-primer
GCTGAGTACCGAGGACAAAG
ASC
F-primer
AGGCCTGCACTTTATAGACC
174 bp
Hs.499094
R-primer
GCTGGTGTGAAACTGAAGAG
caspase-1
F-primer
GAAAAGCCATGGCCGACAAG
205 bp
Hs.2490
R-primer
GCCCCTTTCGGAATAACGGA
IL-1β
F-primer
GGCCCTAAACAGATGAAGTG
90 bp
Hs.126256
R-primer
GTAGTGGTGGTCGGAGATTC
IL-18
F-primer
GCATCAACTTTGTGGCAAT
161 bp
Hs.83077
R-primer
CCGATTTCCTTGGTCAAT
β-actin
F-primer
ACTCTTCCAGCCTTCCTTC
216
bp
Hs.520640
R-Primer
GGAGCAATGATCTTGATCTTC
Immunoassay-ELISA-Konzentrationen von IL-1β und IL zu quantifizieren -18 war ein Standard-Sandwich-enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
verwendet Zytokin-Produktion von IL-1β und IL-18 zu messen. Kurz gesagt, die Überstände von Test (behandelt mit P. gingivalis
, P. gingivalis LPS
, ATP + P. gingivalis in oder ATP + P. gingivalis LPS
) und Kontrollzellkulturen wurden bei jeder Stunde gesammelt ( 1, 2, 3, 4, 5, 6 h), Teilchen durch Zentrifugation und sofort analysiert oder aliquotiert und bei -20 ° C dann entfernt. Human-IL-1β und IL-18 spezifische monoklonale und polyklonale Antikörper (1 ug /ml) wurden vorbeschichtete auf hohe Bindungsplatten mit 96 Vertiefungen (Corning Incorporated, USA) in Carbonatpuffer (pH 9,0) bei 4 ° C über Nacht. Nach der Beschichtungslösung zu entfernen und Waschen der Platte dreimal mit 200 ul PBS /Vertiefung, mit der Platte wurde mit 3% Rinderserumalbumin (BSA, Sigma) bei 4 ° C über Nacht blockiert. Die Testproben wurden hinzugefügt Vertiefungen für 90 min bei Raumtemperatur bis dreifach, und anschließend mit 0,05% Tween20 /PBS (TPBS) dreimal Waschen; dann mit Sekundärantikörper (Ziege-anti-Maus /Kaninchen-IgG (DAKO, Glostrup, Dänemark), konjugiert mit alkalischer Phosphatase (AP)) inkubiert, verdünnt 1: 1500 in TPBS für 2 h bei Raumtemperatur dann mit TPBS Puffer 3-mal gewaschen. Gebundene Konjugate wurden durch pNPP detektiert (p-Nitrophenyl-phosphat) und die Absorption bei 405 nm in einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) nach 15-30 min Inkubation bei Raumtemperatur. Die Reaktionen wurden durch Zugabe eines gleichen Volumens von 1,00 M NaOH gestoppt. Der menschliche IL-1β und IL-18-Konzentration der Proben aus einer Standardkurve interpretiert wurden.
Immunoblots für NLRP3, ASC und Caspase-1-Proteine
Inflammasoms Protein-Expression zu messen, 2- und 4-h-Kulturen von die unterschiedlichen Bedingungen (behandelt mit P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS, ATP 3 h + P. gingivalis in oder ATP 3 h + P. gingivalis
LPS) wurden in SDS-Probenpuffer extrahiert und durch PAGE unter Verwendung von Gradient 5-12% Mini-Gelen getrennt, auf Nitrocellulose-Membranen (Bio-Rad) und über Nacht mit 3% BSA (Sigma) in 0,1 M Tris-gepufferter Salzlösung pH 7,4 (TBS) blockiert. Blotted Antigene wurden mit Kaninchen inkubiert polyklonalen anti-human Antikörper CIAS1 /NALP3, TMS1 /ASC, Caspase-1 (1 & mgr; g /ml, Abcam, Cambridge, UK), und β-Aktin (0,1 ug /ml, Gentex, Zeeland, MI , USA) als Ladekontrolle in 0,05% Tween20 /TBS für 4 h, dreimal gewaschen und anschließend mit alkalischer Phosphatase (AP) -konjugiertem sekundärem Antikörper (Ziege-anti-Kaninchen-IgG, Dako) inkubiert, verdünnt 1: 1500 in Tween20 /TBS für 2 h. Der gebundene Antikörper wurde mit AP-Substrat (Bio-Rad) nach der Entwicklung der Reaktivität für Proteine, die aus Kontroll-Antikörper sichtbar gemacht.
Statistische Analyse
Alle Daten analysiert wurden von t gepaart
-test (Mittelwert ± SD, two-tailed , 95% CI-Bereich) von mindestens drei aufeinanderfolgenden Versuchen für Echtzeit-RT-PCR und ELISA. Für Western-Blot-Quantifizierung wurde die densitometrische Analyse auf der Graustufenintensität der Zielbänder durchgeführt relativen β-Actin-Banden aus gescannten Filmen abgeleitet zu steuern, verarbeitet durch Bildanalyse-Software Gene Tool (GeneToos, Version 4.02; Syngene, Cambridge, UK) [33]. P
& lt; 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet.
Ergebnisse
