Zusammenfassung
Hintergrund
Aufgrund der steigenden Preise von Oropharynxkarzinom, oralen HPV-Infektion ist ein wesentliches Anliegen. Verfahren zur oralen HPV Nachweis ist nicht standardisiert, wie es unterschiedliche Techniken zur Verfügung stehen. Wir schlagen vor, dass die Verwendung von Mundspülung Proben für HPV-Typen zu erkennen, in einer Klinik Einstellung eine geeignete Technik ist. Somit ist unser Hauptziel HPV-Nachweis in Mundspülung Proben zu untersuchen.
Methoden In unserer Studie
verwendeten wir die orale Sammlung Spülung Probe gekoppelt mit Echtzeit-PCR für HPVs Typen zu erfassen 16 und 18, und vorzugsweise verstärkt FAP PCR-Proben für einen breiten Bereich von HPVs, in oropharyngealen Plattenepithelkarzinom (OPSCC), nicht-OPSCC und gesunden Patienten zu erfassen.
Ergebnisse
Dreiunddreißig Prozent von 100 Krebspatienten waren positiv für jede Art von HPV ; Von diesen 23 waren für HPV16 positiv. Nur 1 von 110 gesunden Kontrollpersonen war positiv (dieses Thema positiv für HPV18).
Fazit
Unsere Ergebnisse zeigen, dass HPV-Nachweis in Mundspülung Proben als Screening-Werkzeug nützlich sein können HPV-assoziierten oralen Krebserkrankungen zu erkennen.
Hintergrund
Gewebe von humanen Papillomviren infiziert sind (HPV) haben die Fähigkeit, in einem HPV-assoziierten Krebs zu entwickeln. Dies ist wahrscheinlich auf einen Feldeffekt wo HPV regelmäßige Zellfunktionen ändern können in malignen Erkrankungen führen. Obwohl wir wissen, wie für HPV-assoziierten Krebserkrankungen zu testen, gibt es derzeit keine Standard zum Nachweis von HPV-Infektion [1], und HPV für das Screening könnte für Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom (HNSCC) Personen mit einem Risiko zu identifizieren. Apropos, HNSCC Fälle mit HPV assoziiert gewesen, vor allem Mundhöhle Plattenepithelkarzinom (OSCC) und oropharyngealen Plattenepithelkarzinom (OPSCC) Fällen eine Herausforderung zu screenen, die Teilmengen von HNSCC sind. Der oropharyngeal Bereich umfasst die Basis der Zunge, des weichen Gaumens, Mandeln und Tonsillen Region, mit der Mundhöhle, den Rest der inneren Gewebe des Mundes umfasst. Die gebräuchlichsten Methoden zur HPV-Nachweis im Mund und Mundrachenraum beginnt mit der Sammlung von Zellen mit einem Wattestäbchen, Cytobrush oder eine Mundspülung [2], gefolgt von der Verwendung von PCR-basierten Assays oder DNA in situ Hybridisierung [3]. Es gibt jedoch Probleme vorhanden für bestimmte Techniken. Zum Beispiel begrenzt die Verwendung eines Tupfers /brush die Menge der Schleimhaut, die abgetastet wird, und eine Probe von einem nicht-sichtbare Läsion innerhalb der Tonsillen Krypta erhalten nicht durchführbar sein kann, [4]. Die Basis der Zunge ist nicht ganz zugänglich entweder, da es sowohl flache Schleimhaut und Mandelgewebe ist, wodurch das Risiko für falsch negative Ergebnisse zu erhöhen [5]. Wir entschieden uns für eine Mundspülung Technik für die Probenentnahme zu verwenden, da es nicht-invasiv, schnell und einfach für den Patienten.
Analyzing p16-Expression wurde als Biomarker für die HPV-assoziierten OSCC /OPSCC verwendet worden, aber Studien haben berichtet dass p16-Überexpression nicht immer Fälle in denen onkogene HPV-Typen [6-9]. Eine aktuelle Studie ergab, dass p16 nicht als Surrogatmarker für die HPV-Infektion in oralen Krebserkrankungen zwischen den beiden [10] zu einer schlechten Konkordanz aufgrund verwendet werden. Vor dieser Pannone et al. auch festgestellt, dass p16 Immunhistochemie (IHC) allein keine zuverlässige Methode in HPV-Nachweis für OSCC /OPSCC Fälle [11] zu sein, beweist. Im Rahmen unserer Studie erhielten wir Informationen für p16 Test, um zu sehen, ob unsere HPV-Daten waren in Übereinstimmung.
OPSCC Inzidenz in den entwickelten Ländern zugenommen hat deutlich und HPV-Infektion ist der wichtigste Faktor zu sein vorgeschlagen [12]. Risikofaktoren für die orale HPV-Infektion schließen bestimmte Sexualpraktiken [13-16]; Anzahl der Lebensdauer Partner und Anzahl der bisherigen Sexualpartner, Alter, männlich ist, und aktuelle Zigarettenrauchen [17, 18]. Die am weitesten verbreitete Art von HPV mit oralen Infektion assoziiert ist Typ 16 [17, 19], die in HNSCCs [20] zu onkogenen nachgewiesen wurde. Eine weltweite systematische Überprüfung der HNSCC Biopsien zeigten HPV16 in 31% der Fälle OPSCC; 16% der OSCC Fälle; und 17% der Larynx-SCC Fälle [21]. HPV-Typ 18 erscheint auch eine bedeutende Rolle bei der Krebsentstehung spielen, vor allem im Mund-Rachenraum [22, 23]. Mit dem Aufstieg der OPSCCs
es unerlässlich ist, die für die orale HPV-Nachweis einer Gold-Standard-Technik an ihrem Platz zu haben. Sammeln von Proben aus der Mundhöhle und Oropharynx zum Nachweis von oralen HPV-Typen sollte schnell, nicht-invasive, kostengünstige und ausreichend in HPV-DNA-Sammlung. In unserer Studie untersuchten wir Mundspülung Proben in Verbindung mit Echtzeit-PCR Taqman Assays für HPV-Typen 16 und 18 zu erkennen, die empfindlich und spezifisch ist. Um sich für ein breites Spektrum von HPVs erkennen wir die Mundspülung Proben von Krebsfällen bevorzugt verstärkt und verwendet fluoreszierende willkürlich grundiert (FAP) PCR, eine allgemeine PCR-Verfahren unter Verwendung von degenerierten HPV-Primer.
Studie Bevölkerung
Zwischen 2011 und 2013 stellten wir 76 OPSCC und 24 Nicht OPSCC Patienten aus der Seattle Cancer Care Alliance (Seattle, WA) und 110 gesunden Probanden von der University of Washington Dental Clinic (Seattle, WA). Nicht OPSCC Fälle waren Patienten mit OSCC, Kehlkopf-, Sinus und Supraglottis Krebserkrankungen. Wir gesiebt, um die Zeitpläne von fünf Onkologen, um anspruchsberechtigt Krebspatienten zu identifizieren und besprachen unsere Studie bei ihrer Ernennung. Ein Patient ging aufgrund der wunde Stellen im Mund und Empfindlichkeit. 21/100 Krebspatienten bereits Behandlung und dieser 21 Patienten begonnen: 18 Patienten hatten Behandlung weniger als 21 Tage vor der Probenahme, zwei mehr als 30 Tagen nach der Behandlung hatten, und ein Patient hatte Behandlung für 7 Monate. Gesunde Probanden zufällig innerhalb der Studentenzahnklinik ausgewählt wurden, lehnte einen Patienten an der Studie teil zu nehmen. Aufnahmekriterien für die gesunde Bevölkerung enthalten sind: Krebs-frei, nicht schwanger, HIV-frei, und über dem Alter von 16. Jeder Patient schriftliche Einverständniserklärungen unterzeichnet in der Studie (IRB # 7490 9. April genehmigt, 2014) teilzunehmen, und eine einfache Gesundheits-Fragebogen beantwortet. Geschlecht, Alter, Rasse, Rauchen, Alkohol und Marihuana Geschichte wurden für alle Probanden aufgezeichnet. Charts für eine Untergruppe von Patienten wurden für p16 Immunhistochemie (IHC) und HPV-Tests überprüft
Methoden
Kollektion & amp. DNA-Reinigungsmethoden
für die Probenentnahme, alle Patienten gespült und gurgelte für 30 s mit Original-Mint Scope® Mundwasser (Procter & amp; Gamble). Vier normale gesunde Personen angefordert Crest® alkoholfreie Mundwasser aufgrund einer Geschichte von Alkoholismus zu verwenden. Mundspülung Proben wurden für 15 min zentrifugiert. bei 4 ° C unter Bildung eines Pellets wurde der Überstand verworfen und das Pellet wurde in -80 ° C bis zur weiteren Verarbeitung gegeben. Die Puregene® DNA Purification Kit wurde verwendet, um genomische DNA aus der bukkalen Zellpellet innerhalb der Mundspülproben (QIAGENs Artikel # 158467, Hersteller Protokoll gefolgt wurde) zu isolieren. Waren alle menschlichen Probanden IRB-Protokolle und Vorschriften
Fred Hutchinson Cancer gefolgt unter . Research Center Richtlinien (IRB # 7490 genehmigt 9. April 2014)
HPV & amp; analytische Methoden
Taqman Echtzeit-PCR-Assays wurden zum Nachweis auf dem ABI Prism 7900 Sequence Detection System mit 40 Zyklen in einem Reaktions (Denaturierung bei 95 ° C, Annealing und Extension bei 60 ° C) eingesetzt. Absolute Quantifizierung wurde verwendet, HPV16 und 18 Viruslast und die Gesamt menschliche genomische DNA in der Probe zu bestimmen ist am Alu-Sequenzen bestimmt. Serielle Verdünnungen von menschlicher genomischer DNA und in voller Länge HPV16 und 18 Plasmide, von bekannten Konzentrationen wurden als Standardkurven verwendet
HPV16 E7 Grundierungen
Weiterleiten. CGGACAGAGCCCATTACAATATT
: CGCACAACCGAAGCGTAGA
HPV16 E7 Sonde: TAACCTT (T /C) TGTTGCAAGTGT
HPV18 E7 Primers:
Weiterleiten: CCGACGAGCCGAACCA
Reverse: TGGCTTCACACTTACAACACATACA
HPV18 E7 Sonde: AACGTCACACAATGTT
um die Effizienz von HPV-Nachweis zu erhöhen, haben wir die mehrfach grundiert verwendet Rollkreisverstärkungstechnik (MP-RCA), um vorzugsweise unbekannt, Kreis HPV-DNA zu verstärken. MP-RCA bis zu 107-fach [24] zirkuläre DNA-Vorlagen zu verstärken nachgewiesen wurde. Die TempliPhi 100 Amplification Kit (Amersham Biosciences) Protokoll wurde gefolgt.
Die FAP PCR veröffentlichten Protokoll für ein breites Spektrum von HPV-Typen zu erkennen, wurde gefolgt, wo Primer von konservierten Regionen L1 entwickelt wurden [25]. Wir führten diese Technik nur auf die Krebs Fall Proben (Fig. 1). Feige. 1 FAP PCR-Ergebnisse auf einem Elektrophorese-Gel. Eine erwartete Bande von ~ 480 bp zeigt eine HPV-positive Probe kaufen Wir Rauchen Geschichte wie folgt unterteilt: Nichtraucher (0 Packungen); Licht Raucher (& lt; 1pack /Woche); moderate Raucher (≥1pack /Woche ≤1 Packung /Tag); starker Raucher (≥1pack /Tag). Für diejenigen, die Zigarren oder gekaut Tabak geraucht wir auf das Äquivalent von Verpackungen von Zigaretten geraucht berechnet. Alkohol Geschichte wurde wie folgt unterteilt: keine (nie trinkt); selten /gelegentlich (1 trinken alle 1-2 Monate); Licht (1-6 Getränke /Woche für Frauen, 13.01 Getränke /Woche für Männer); mittel (7 Getränke /Woche für Frauen, 14 Getränke /Woche für Männer); schwer (& gt; 7drinks /Woche für Frauen, & gt; 14 Getränke /Woche bei Männern).. Alle Datenanalyse
wurde mit Stata MP 13.1 (StataCorp LP, Texas, USA) durchgeführt
Ergebnisse
