Zusammenfassung
Hintergrund
Um die mikrobielle Zusammensetzung von Biofilmen an entzündeten periimplantärer und parodontalen Gewebe in dem gleichen Thema, mit 16S rRNA untersuchen Sequenzierung.
Methoden
supra- und submuköse und supra- und subgingivale Plaqueproben von 7 Probanden gesammelt wurden aus erkrankten periimplantärer und parodontalen Gewebe leiden. Bacterial DNA wurde isoliert und 16S-rRNA-Gene wurden amplifiziert, sequenziert und zur Identifizierung von Bakteriengattungen ausgerichtet sind.
Ergebnisse
43734 Chimäre abgereicherte wurden denoised Sequenzen identifiziert, auf 1 phylum entspricht, 8 Klassen, 10 Aufträge, 44 Familien und 150 Gattungen. Die häufigsten Familien oder Gattungen in supramucosal oder supragingival Plaque waren Streptoccocaceae, Rothia
und Porphyromonas.
Submukosa-Plakette, die am häufigsten vorkommende Familie oder Gattungen gefunden waren Rothia, Streptococcaceae
und Porphyromonas
auf Implantaten . Die häufigsten subgingivalen Bakterien auf den Zähnen waren Prevotella, Streptococcaceae, Poster und TG5.
Die Anzahl der Sequenzen für die Gattungen Tanner
und Aggregatibacter
auf Implantaten unterschieden sich signifikant zwischen supra- und Submukosa-Standorten vor mehreren gefunden testen. Die Analysen zwischen microbiomes auf Implantaten und Zähnen in supra- oder submuköse und supra- oder subgingivalen Biofilmen keine signifikanten Unterschiede nachgewiesen werden.
Fazit
Diseased periimplantärer und parodontalen Gewebe in der gleichen Bakteriengattungen similiar unterliegen Aktien und basiert auf der Analyse von Taxa auf einem Gattungsebene Biofilm Zusammensetzungen bei Implantaten oder Zähne können nicht für die potentiell unterschiedliche Pathologien erklären.
Schlüsselwörter Tief Sequenzierung 16S rRNA-Sequenzierung Diseased periimplantären Gewebe Diseased parodontalen Gewebe supragingivale Plaque subgingivale Plaque Biofilm Mikrobiologie Jörg Eberhard und Meike Stiesch trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit elektronische ergänzendes Material
die Online-Version dieses Artikels
. (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-157) enthält zusätzliches Material, das zur Verfügung steht autorisierte Benutzer.
Hintergrund
Zahnimplantate sind häufig zu ersetzen fehlende Zähne in teilbezahnten oder zahnlosen Patienten eingesetzt. Die Entzündung der periimplantären Weich- und Hartgewebe ist die häufigste unerwünschte Ereignis und kann die Langzeitstabilität von osseointegriert Implantate gefährden. Während periimplantären Mukositis affectes nur Weichgewebe, Periimplantitis beinhaltet auch die Unterstützung von Knochen. Die Prävalenz von Periimplantitis während 5-10 Jahre nach der erfolgreichen Osseointegration scheint in der Größenordnung von 10% der Implantate und 20% der Patienten [1] zu sein.
Accepted Risikofaktoren für periimplantärer bedingte Krankheiten sind schlechte Mundhygiene , eine Geschichte von Parodontitis und Zigarettenrauchen [2]. Biofilme wurden im Detail durch Verwendung von Hybridisierungstechniken in Periimplantitis [3-6] und vor kurzem durch Hochdurchsatz-Sequenzierungstechniken in Ermangelung Implantate [7-9] beschrieben. Supra- und submuköse Biofilmen auf Implantaten in einzelnen Fächern nicht durch Verwendung von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechniken beschrieben worden ist, obwohl es, dass die Zusammensetzung von supragingivalen biofims signifikant subgingivalen Biofilmbildung beeinflusst gezeigt worden ist [10-12]. Folglich supramucosal Biofilme können auch die Zusammensetzung des submukösen Mikroflora bestimmen. Die unterschiedlichen Oberflächeneigenschaften (chemische Zusammensetzung, Oberflächenrauhigkeit, Oberflächenenergie) und Gewebearchitektur bei Implantaten und Zähnen sowie bakterielle Adhäsion und das Wachstum von Biofilmen beeinflussen können [13] und für die vorgeschlagenen Unterschiede in Entzündungsreaktion auf Implantate und Zähne verantwortlich sein kann [ ,,,0],14].
daher das Ziel der vorliegenden Studie die mikrobielle Zusammensetzung von supra- und submuköse, repectively supra- und subgingivalen Plaques bei erkrankten Implantate und Zähne.
Methoden
Thema Auswahl
weiter zu charakterisieren war Themen in der Studie hatten mindestens ≥30% Standorten mit PD ≥4 mm und offensichtlich röntgenologischen Knochenverlust. Alle Patienten waren teilbezahnte (nicht weniger als 8 Zähne), mit mindestens 1 oral Implantat mit Kronen oder Prothesen wieder funktioniert. Einschlusskriterien waren: (A) ein Implantat und Zähne Anzeichen einer aktiven Entzündung (tissue mit manifester Anzeichen einer Entzündung (Rötung und Schwellung) zeigt, Blutung auf Sondierung (BOP) und Taschentiefe (PD) ≥ 4 mm in zumindest einer Stelle und Nachweis radiographischer Knochenverlust), (B) hatten Implantate für mindestens 1 Jahr zu funktionieren. Ausschlusskriterien waren: (A) jede periimplantärer oder Parodontalbehandlung 6 Monate vor der Probenahme. (B) systemische Erkrankungen wie Diabetes mellitus, (C) Das Rauchen, (D) antibiotische oder immunsuppressive Medikamente innerhalb der letzten 3 Monate.
Eine umfassende Anamnese aufgenommen wurde, gefolgt von klinischen und röntgenologischen Untersuchung. Die Einwilligungserklärung erhalten, und die Studie wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Hochschule Hannover genehmigt (Nr. 4348).
Klinische Prüfung
Zwei erfahrene Zahnärzte alle Fächer untersucht. Taschentiefe wurde mit einem Druck kalibriert Parodontalsonde (Hawe Click-Probe, Kerr Hawe SA, Bioggio, Schweiz) gemessen. Probing Tiefe wurde auf den Millimeter genau auf der Skala gemessen. Blutung bei Sondierung wurde beurteilt nach der Sondierung einer dichotomous Maßnahme verwenden. Alle Messungen wurden auf 4 Seiten aller Implantate und Zähne durchgeführt. Plaque-Ablagerungen wurden (An- /Abwesenheit) ohne Färbung aufgezeichnet, um ein modifiziertes Approximal Plaque-Index (API) verwendet [15].
Musterkollektion
In jedem Fach das Implantat und dem Zahn mit den tiefsten Tiefen für die Plaque ausgewählt wurden Sammlung. Nach Isolierung wurden die Probefläche mit Watterollen und schonende Trocknung mit einer Luftspritze, 2 sterile Endodontie Papierspitzen (Absorbent Papier Punkte, VDW GmbH, München, Deutschland) supramucosally oder supragingival verwendet, um die Biofilme zu sammeln. Anschließend wurden die Rest supramucosal und supragingivalen Plaques vollständig mit einem Zahnsteinentferner entfernt. Zwei sterile Papierspitzen wurden dann submukös oder subgingival platziert. Die Proben wurden separat für jedes Implantat, Zahn und Standort gesammelt und wurden in 2 ml Kryoröhrchen (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) und sofort eingefroren bei -80 ° C vor der Verarbeitung.
DNA-Extraktion und Sequenzierung
DNA-Isolierung platziert
Papierpunkte für die Abtastung verwendet wurden für 30 min bei 37 ° C mit 360 & mgr; l Lysozym-Lösung behandelt (20 mg /ml Lysozym, 20 mM TrisHCl, 2 mM EDTA, 1,2% Triton X100, pH 8,00), gefolgt von Proteinase-K-Verdau für 30 min bei 56 ° C in 400 & mgr; l Puffer AL (Qiagen, Hilden, Deutschland). Enzyme wurden für 15 min durch Erwärmen auf 95 ° C inaktiviert. Sterile 0,5 mm Glasperlen (Roth, Karlsruhe, Deutschland) wurden zugegeben und Bakterienzellen wurden durch kräftiges gestört Schütteln (6500 rpm, 3 x 20, 15s Pause) mit einem Precellys 24 Perlmühle (Bertin Technologies, Montigny-le-Bretonneux, Frankreich ). Anschließend wurde Gesamt-DNA aufgereinigt mit dem QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß dem Protokoll des Herstellers für gram-positive Bakterien (QIAamp ® Mini DNA and Blood Mini Handbook, Third Edition, Appendix D).
16S rDNA-Amplifikation und Probenvorbereitung
aus jeder Probe ein ca. 550 bp Fragment des 16S-rRNA-Gens wurde unter Verwendung des breiten Bereich Primern amplifiziert 27f (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') und 521R (5'-ACCGCGGCTGCTGGCAC-3 '; beide Eurogentec, Seraing, Belgien). Die Primer gezielt konservierte DNA-Sequenzen, die V1 und V3 hypervariablen Regionen der 16S-rRNA-Gen flankieren. PCR wurde auf einem TProfessional Thermocycler (Biometra, Göttingen, Deutschland) in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 ul durchgeführt. Das PCR-Gemisch enthielt etwa 20 ng Matrizen-DNA, 200 nM von jedem Primer, 1 x PCR-Puffer (mit 1,5 mM Magnesiumchlorid; Qiagen, Hilden, Deutschland), 1,5 HE HotStar Taq-Polymerase (Qiagen, Hilden, Deutschland), 200 mM jeder dNTP (Roth, Karlsruhe, Deutschland) und PCR-grade Wasser (Roche, Penzberg, Deutschland). PCR-Bedingungen waren wie folgt: Anfängliche Denaturierung bei 95 ° C für 15 min; 32 Zyklen Amplifizierung mit Denaturierung bei 94 ° C, bestehend für 1 min, Annealing bei 52 ° C für 40s, Elongation bei 72 ° C für 1 min; abschließende Extension bei 72 ° C für 10 min. PCR-Reaktionen wurden auf einem 1,0% Agarosegel aufgetrennt (Agarose MP, AppliChem, Darmstadt, Deutschland) aufgereinigt und unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland). XXXXXXXXXXX = einzigartig; die aufgereinigten Amplicons jeder Probe wurden als Matrize für eine zweite PCR-Schritt mit dem Primer 27f-adab (5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGAGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') und einen einzelnen Rückwärtsprimer 521R-MID_X (5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGXXXXXXXXXXXACCGCGGCTGCTGGCAC-3 'verwendet, MID-tag) eine einzigartige Multiplex-Identifier (MID) Barcode Sequenz enthält. Verstärkungschemie war die gleiche wie oben beschrieben, jedoch wurden 100 ng Template-DNA pro Reaktion verwendet wurden, wurde die Wärmebehandlungstemperatur auf 67 ° C erhöht und die Zykluszahl wurde reduziert bis 15 PCR-Reaktionsprodukte wurden gereinigt durch Agarose-Gelelektrophorese und extrahierte wie zuvor beschrieben. Die DNA-Konzentrationen wurden unter Verwendung des AccuBlue ™ High Sensitivity dsDNA Quantifizierungskit (Biotium, Hayward, USA) in Kombination mit einem Fluoreszenzreader BioTekSynergy II bestimmt (BioTek, Bad Friedrichshall, Deutschland). Anschließend wurden die Proben in einem äquimolaren Verhältnis gemischt und weiterverarbeitet gemäß den Anweisungen des Herstellers für die Titanium-Bibliothek Preparation Kit (Roche, Penzberg, Deutschland). Pyrosequencing wurde auf einem GS FLX Sequenzer (Roche, Penzberg, Deutschland).
Bioinformatics
Sequenzverarbeitung
Qiime Software Version 1.6 [16] für die Vorverarbeitung verwendet wurde, die Identifizierung von operativen taxonomischen Einheiten (OTU), die taxonomische Zuordnung und die Gemeinschaftsstruktur Vergleiche. In der Vorlauf Schritt wurde jeder 454-Lese entfernt werden, wenn (a) die Anzahl der Basenpaare war & lt; 200 oder & gt; 550, (b) die Qualität der Gäste war & lt; 25, (c) die Anzahl der mehrdeutigen Basen war & gt; 6, (d) es einen Primer Mismatch, (e) die Anzahl der Fehler in Barcode waren & gt; 1,5, oder (f) ein Homopolymer Lauf war & gt; 6. Zusätzlich zu diesen Qualitätsfilterschritte, ein Entrauschen Schritt der Sequenzen wurde durchgeführt [17] mit dem "denoise_wrapper" -script in qiime. Chimäre Sequenzen wurden unter Verwendung ChimeraSlayer mit den qiime Standardeinstellungen nach OTU-Picking und taxonomische Zuordnung entfernt.
OTU Zuordnung und taxonomische Klassifizierung
Die Sequenzen zu OTUs mit dem uclust Verfahren in qiime mit einer Ähnlichkeitsschwelle von 0,97 zugewiesen wurden, die entspricht Gattungsebene OTUs. Für die folgende taxonomische Zuordnung verwendeten wir das Strahlverfahren in qiime mit den Greengenes mit 97% OTUs als der Referenzdatenbank 12_10 Release. Darüber hinaus wurden Gattungen nach ihren Gram-Färbung kategorisiert basierend auf Bergey Manual of Systematic Bacteriology.
Statistische
Der OTU-Tabelle von qiime nach Entrauschen und Chimäre erstellt Analysen in die statistische Programmiersprache R importiert wurde Prüfung [18] mit dem Bioconductor [19] Paket phyloseq [20]. Die folgenden grafischen Analysen wurden durchgeführt, auch die phyloseq Paket mit und wurden für (a) die gesamte Datensatz, (b) das Implantat Teilmenge und (c) die Zahnteilmenge erstellt. Die taxonomische Rang für die folgenden Analysen verwendet wurde, war die Gattung Ebene. Zunächst Heatmaps für die 50 am häufigsten vorkommenden Bakterien wurden erstellt. Zweitens, Hauptkoordinaten Analysen (HKoA) von Unifac Entfernungen wurden berechnet und aufgetragen. Die folgernd statistische Analyse wurde mit dem Bioconductor Paket Edger berechnet [21]. Deshalb log fold changes und entsprechende Vielzahl bereinigten p-Werte aus getrennten verallgemeinerten linearen Modelle für jede Gattung mit Patienten als Kovariate und unter Berücksichtigung des gepaart Design-Charakter geschätzt wurden. Biodiversität wurde berechnet, um den Shannon-Diversity-Index mit [22].
Ergebnisse
