Zusammenfassung
Hintergrund gepfropft
Anbetracht dessen, dass gepfropften Gingiva könnte an den Rezeptor Bereich angepasst werden müssen, und dass Fibroblasten die Fähigkeit haben, zu reagieren, die Freisetzung verschiedener Zytokine, um bakterielle Reize durch diese Studie untersucht, ob Fibroblasten aus der Gaumenschleimhaut sich anders verhalten, wenn sie auf den Zahnfleischsaum in Bezug auf die Zytokinsekretion gepfropft.
Methoden
Biopsien aus der Gaumenschleimhaut zum Zeitpunkt der freien gesammelt wurden Gingivatransplantat Chirurgie, und nach vier Monaten wieder Kollektion wurde bei der Operation für die Wurzeldeckung durchgeführt. Fibroblasten wurden von der Explantat-Technik isoliert, kultiviert und stimuliert mit Porphyromonas gingivalis
(Pg
) und Escherichia coli
(Ec
) LPS für 24 oder 48 h für die vergleichende Bewertung der Sekretion von Zytokinen und Chemokine, wie IL-6, IL-8 /CXCL8, MIP-1α /CCL3, TGF-β, VEGF und CXCL16. Unstimulierte Zellen wurden als Kontrollgruppe verwendet. Die Zellen wurden auf Lebensfähigkeit durch einen MTT-Assay getestet, und die Sekretion von Zytokinen und Chemokinen in den Zellüberständen durch Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) wurde bewertet.
Ergebnisse
Fibroblasts aus der Gaumenschleimhaut gehalten, um das gleiche Muster Sekretion von IL -6, wenn sie auf den Zahnfleischsaum gepfropft. Im Gegenteil zeigte Fibroblasten vom Rand Gingivatransplantat erhöhte Sekretion von IL-8 /CXCL8, selbst in Abwesenheit von Stimulation. Interessanterweise MIP-1α /CCL3 Sekretion von Fibroblasten aus dem marginalen Gingivatransplantat wurde nach 48 Stunden Stimulation mit Pg
LPS und nach 24 h mit Ec
LPS signifikant erhöht. Nur Fibroblasten aus dem marginalen Gingivatransplantat zeigte die Sekretion von TGF-β. VEGF und CXCL16 Sekretion wurden nicht von beiden Untergruppen von Fibroblasten nachgewiesen.
Fazit
Fibroblasten aus der Gaumenschleimhaut scheinen auf die örtlichen Gegebenheiten des Standortes Mikro angepasst werden, wenn sie auf dem gingivalen Randbereich gepfropft. Dieser Nachweis unterstützt die effektive Beteiligung von Fibroblasten in der Homöostase des marginalen Parodontiums durch Sekretion Modulation wichtige Entzündungsmediatoren.
Schlüsselwörter Periodontitis Gingivafibroblasten Cytokine Chemokine Entzündung elektronische ergänzendes Material
Die Online-Version dieses Artikels (doi . in Gewebeentzündung führen bakterielle Plaque Exposition Gingivagewebe mit klinischen Anzeichen von Farbwechsel 10 1186 /1472-6831-14-21) enthält zusätzliches Material, das autorisierten Benutzern zur Verfügung
Hintergrund
kann. , Größe, Form, Konsistenz und mit der Möglichkeit der Alveolarknochen Verlust Blutungen aufgrund Parodontitis Progression [1]. Der kumulative Effekt und sich wiederholende pathologischen Ereignisse Gingivagewebe auf das Auftreten und Fortschreiten der Rezession führen kann, insbesondere in Fällen mit schmalen Band oder Abwesenheit von Gingiva [2-4].
Nach Angaben der American Academy of Periodontology, parodontale plastische Chirurgie kann die gingivale Breite zu erhöhen angegeben werden, eine tiefere Vorhalle in Bereichen mit abnormen frenum Befestigung und unzureichend befestigter Gingiva [5] an. Obwohl die keratinisierten Mukosa Breite und Gingiva sind genetisch bestimmt, können sie durch die Anwesenheit von bakterieller Plaque mit einer Entzündung oder durch mechanische Eingriffe [6] zugeordnet berührt.
Es wurde gefunden, dass Fibroblasten gezeigt ist, abgesehen davon, daß die wichtigsten Zellen in die Wartung und Umbau des Bindegewebes extrazellulären Matrix werden in Immun- und Entzündungswirtsantwort in periodontalen Erkrankung beteiligt sind, da sie die vorherrschende Strukturzellen in parodontale Infektionen, die durch anaerobe Bakterien wie Porphyromonas gingivalis (Pg)
sind und stimuliert inflammatorischen Zytokinen auf Pg
und seine Subprodukten Herausforderung zu lösen [7-11]. Abgesehen davon, dass empfindlich auf ihre eigenen Zytokine und Wachstumsfaktoren, können sie direkt mit Bakterien und deren Virulenzfaktoren interagieren, einschließlich Lipopolysacchariden (LPS) in periodontal Läsionen [12].
Bezüglich Rolle Gingivafibroblasten in Reaktion auf Pg
LPS durch Zytokine Freisetzung wurde zuvor gezeigt, dass diese Zellen Differentialverhalten von Desmodonts aus den gleichen Spender zeigen, die Individualität des anatomischen Region bestätigt in der Zellantwort zu bestimmen [9]. Insbesondere für IL-6 und IL-8 /CXCL8, einem bekannten Chemokin für Neutrophile Einstellung erforderlich ist, wurde berichtet, dass diese Zellen große Mengen zu sezernieren, sind in der Lage, wenn sie von Pg
LPS stimuliert [8, 13-15] . Zusätzlich sekretieren Gingivafibroblasten auch das Chemokin MIP-1α /CCL3 auf Monozyten chemischen Anziehung in Parodontalerkrankungen impliziert [16] sowie TGF-β, die die Expression von pro-Kollagen Typ I induziert [17]. VEGF ist ein anderes Zytokin an der Entstehung von Parodontitis im Zusammenhang aufgrund der Fähigkeit, die vaskuläre Permeabilität zu erhöhen, die für die Verbreitung der Entzündung beiträgt, wodurch Entzündungsmediator-Freisetzung durch Zellen im entzündeten Gewebe und ermöglicht die Bildung neuer Blutgefäße [18]. Außerdem wird das Chemokin CXCL16 durch andere Zytokine fördern Gingivafibroblasten Proliferation und Leukozyten-Migration in entzündetes Gewebe induziert die parodontalen Gewebe hilft Kabinettsumbildung [19, 20]. Nach bestem Wissen und Gewissen, hat keine früheren Arbeiten die Sekretion Profil der zuvor genannten Zytokine Vergleich der Fibroblasten von Gaumenschleimhaut adressiert (in der Regel als autogenem Spenderstelle für Gingivatransplantat Verfahren verwendet wird) mit Zellen von marginalen gingivalen Bereich stammen.
Gepfropft Gingiva könnte an den Rezeptor Bereich angepasst werden müssen, und es ist eine große Menge an Beweisen, dass gingivale Fibroblasten können auf verschiedene Stimuli durch Zytokine und Chemokine Freisetzung zu reagieren, was wiederum eine wichtige Rolle bei der Entzündungsantwort spielen. Daher ist diese Studie zielte darauf ab, zu untersuchen, ob die Sekretion von Zytokinen und Chemokinen einschließlich Reparatur Mediatoren durch menschliche Gingivafibroblasten moduliert werden würde, wenn sie von der Gaumenschleimhaut auf den gingivalen Randbereich in einem freien Gingivatransplantat Verfahren gepfropft.
Methoden
Probensammlung und Fibroblasten Primärkultur
nach Zustimmung des Institutional Review Board der Bauru School of Dentistry, Universität von São Paulo, # 055/2011, drei systemisch und parodontal gesunden Personen (28, 38 und 50 Jahre alt, 3 Frauen) wurden in Parodontologie Kliniken, von denen alle benötigten Wurzeldeckung in Gebieten mit knappen verhornte Schleimhaut ausgewählt. Sie hatten keine Anzeichen von Zahnfleischentzündung, keine Blutung auf Sondierung oder kritische Sondierungstiefe. Alle Personen wurden zur Anamnese, klinische Untersuchung parodontalen und röntgenologische Untersuchungen vorgelegt. Die Einschlusskriterien waren Personen mit mangelhaft verhornte Schleimhaut, sowohl in Quantität und Qualität, ohne systemische Komplikationen, die die chirurgischen Verfahren, und dass eine schriftliche Einverständniserklärung in der Studie teilzunehmen.
Die Gaumenschleimhaut Proben, in der Größe 3x3 mm kontraindizieren könnte, sofort erhalten wurden, wenn ein Epithel-Bindegewebstransplantat von palatinal Spenderstelle auf der Prämolaren-Bereich während des freien Gingivatransplantat Chirurgie [21] entfernt wurde. während eines zweiten chirurgischen Eingriff für die Wurzeldeckung Nach vier Monaten Proben aus Gingivatransplantat wurden aus dem Randbereich erhalten. Fibroblasten wurden von der Explantat-Technik isoliert, wie zuvor beschrieben [8-11]. (; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA DMEM), ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum (FBS; Gibco, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium Kurz gesagt, wurden die Proben sofort verarbeitet. Die epitheliale Schicht wurde entfernt und die Proben wurden so klein wie möglich zerkleinert. Gewebefragmente von Gaumenschleimhaut oder Gingivatransplantat wurden getrennt in Petrischalen ausgestrichen und bedeckt mit DMEM, das mit 20% FBS und Antibiotika (600 & mgr; l /ml Penicillin, 300 & mgr; l /ml Gentamicin-Sulfat und 100 & mgr; l /ml Amphotericin B). Die Explantate wurden in 25 cm
2 Kolben beimpft und bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 platziert. Das Medium (DMEM 10% FBS) wurde alle 2-3 Tage gewechselt und Kulturen gehalten wurden, bis Fibroblasten Zusammenfluß erreicht. Nach Konfluenz wurden die Fibroblasten zwischen dem vierten und achten Passagen [8-11].
Fibroblasten Stimulation
Die Zellen wurden in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 2 × 10 4 Zellen geerntet und verwendet /gut und bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 während 18 Stunden in DMEM 1% FBS inkubiert. Nachdem über Nacht Adhäsion, DMEM, enthaltend 1 & mgr; g /ml Pg
LPS (Invivogen, San Diego, CA, USA) oder Ec
LPS (Invivogen) wurde für 24 oder 48 h in die Vertiefungen gegeben. Nicht-stimulierten Zellen wurden als Kontrollen verwendet. Sowohl Pg
LPS und Ec
LPS waren Reinst-und gekauft von Invivogen.
Phänotypischen Charakterisierung von Fibroblasten
Zellen, die aus der Gaumenschleimhaut und Gingivatransplantat als Fibroblasten durch ihre Morphologie und Färbung mit Fibroblasten-Oberfläche charakterisiert Protein (FSP; 11333 ab, Abcam, Cambridge, UK) mittels Immunfärbung [11]. Zellen wurden in einem 8-Well-Platte ausgesät und mit 1 × 10 4 Zellen pro Well und bei 37 ° C mit 5% CO inkubiert 2 während 18 Stunden in Subkonfluenz zu haften. Anschließend wurden die Vertiefungen in Gruppen eingeteilt (Kontrolle, Pg
LPS, Ec
LPS und negative Kontrolle, die ohne den primären Antikörper durchgeführt wurde) in zweifacher Ausfertigung, die Stimulation zu Zelle. Zellen wurden mit Paraformaldehyd 4% (15 min) festgelegt und wurden 3-mal mit 1x PBS gewaschen und mit PBS BSA 3% (30 min bei Raumtemperatur), gefolgt von primären monoklonalen Antikörper-Inkubation inkubiert Oberflächenmarker auf 1 verdünnt Fibroblasten: 100 (2 & mgr; g /ml Endkonzentration) und schließlich mit Fluorescein-konjugiertem sekundärem Antikörper (1: 400) (Abcam) bei 37 ° C im Dunkeln für 1 Stunde. Die Deckgläser wurden mit Eindeckmediums Vectashield Hart Set Montageart Medium, das 49,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI; H-1500, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) und durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskop (TCS Modell analysiert, SPE , Leica Mannheim, Deutschland). Die Zelllebensfähigkeit
Lebensfähigkeit Zelle wurde aus der enzymatischen Aktivität mit einem kolorimetrischen Assay MTT [3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid] analysiert. Kurz gesagt wurden mit 1 × PBS gewaschen Zellen Kulturmedium und MTT (5 mg /ml) zugegeben, die zu den Gruppen (Kontrolle, Pg
LPS und Ec
LPS) oder zellfreie Vertiefungen (blank) zu entfernen. Die Platte wurde bei 37 ° C mit 5% CO 2 während 4 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Platte (200 g
während 7 Minuten bei 21 ° C) zentrifugiert und MTT-Lösung Dimethylsulfoxid hinzufügen entfernt (DMSO, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Die optische Dichte der Vertiefungen wurde mit einem Plattenleser (Fluostar Optima, BMG Labtech, Ortenberg, Deutschland) in der Wellenlänge von 570 nm verwendet wird.
Enzyme-Linked Immuno Assay (ELISA)
ELISA wurde nach Angaben des Herstellers durchgeführt Anweisungen, um die Proteinspiegel von IL-6 zu bestimmen (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN, EUA), IL-8 /CXCL8 (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN, EUA), MIP-1α /CCL3 (R & amp; D System, Minneapolis, MN, EUA), TGF-β (eBioscience, San Diego, CA, USA), VEGF (PeproTechs, London, UK) und CXCL16 (PeproTechs, London, UK). Kurz gesagt, Platten von 96 Vertiefungen wurden mit Einfang-Antikörper anti-IL-6, IL-8 /CXCL8, MIP-1α /CCL3, TGF-β, VEGF oder CXCL16 verdünnt in 1x PBS-Puffer inkubiert. Nach 1 Stunde wurden Blockierung zu vermeiden unspezifischen Bindung wurden 100 ul Standard-IL-6, IL-8 /CXCL8, MIP-1α /CCL3, TGF-β, VEGF und CXCL16 und Kulturüberständen gegeben. Die Cytokine wurden mit Meerrettichperoxidase-markierten monoklonalen Antikörpers an jedes Target nach Zugabe von 100 ul anti-human IL-6, IL-8 /CXCL8, MIP-1α /CCL3, TGF-β, VEGF und CXCL16 biotinylierten Antikörper platziert wurden nachgewiesen in jede Vertiefung gegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mikrotiterplatte wurde gewaschen, um ungebundene Enzym-markierte Antikörper zu entfernen. Die Menge an Meerrettichperoxidase zu jedem Well gebunden wurde durch die Zugabe von 100 ul Substratlösung bestimmt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 100 ul 1 M Schwefelsäure gestoppt, und die Platten wurden bei 450 nm (Synergy ™ MX Monochromator Based Multi-Mode Microplate Reader, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) abgelesen. Die Konzentrationen von IL-6, IL-8 /CXCL8, MIP-1α /CCL3, TGF-β, VEGF und CXCL16 wurden durch Interpolation aus einer Standardkurve bestimmt und als pg /ml für Duplikat-Assays von Duplikatproben von jedem der dargebotenen getesteten Bedingungen.
Vergleiche für die Lebensfähigkeit durch MTT
statistische Analyse unter den Proben von Tukey-Test gefolgt Einweg-ANOVA-Test durchgeführt wurden. ELISA-Daten Normalität wurde von der Kolmogorov-Smirnov-Methode überprüft. Die statistischen Unterschiede wurden durch Drei-Wege bestimmt ANOVA durch Tukey-Test gefolgt. Statistische Analysen wurden mit STATISTICA (; StatSoft Inc Version 11.0) durchgeführt. P-Werte & lt; 0,05 wurden als signifikant angesehen. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert und eine Standardabweichung vom Mittelwert ausgedrückt.
Ergebnisse | phänotypischen Charakterisierung von Fibroblasten
Cellular Färbung mit einer Fibroblasten-Oberflächenmarker (FSP) wurde die fibroblastic Phänotyp zu bestätigen durchgeführt. Fibroblasten mittels Immunfluoreszenz in allen Gruppen analysiert wurden (Kontrolle, Pg
LPS, Ec
LPS und Negativkontrolle). Eine positive Färbung wurde für alle Gruppen (Abbildung 1) beobachtet, mit Pg
LPS (1C) und Ec
LPS (Abbildung 1B) Gruppen etwas höher zu sein. Für die negative Kontrollgruppe (1D), die keine primären Antikörper erhalten haben, wurde kein Signal nachgewiesen. Dieses Ergebnis bestätigt die Charakterisierung der kultivierten Zellen wie Fibroblasten. Abbildung 1 Zellen Charakterisierung von Fibroblasten-Protein Oberflächenfärbung. Kultivierte Zellen wurden Fibroblastenoberflächenprotein (FSP) und analysiert durch ein konfokales Mikroskop mit einem Anstieg von 63x immunogefärbt. (A) Kontrolle; (B) stimuliert durch Ec
LPS; (C) von Pg stimulierte
LPS und (D) negative Kontrolle, markierten Kerne in blau (DAPI).
Lebensfähigkeit der Zellen
Die Lebensfähigkeit der Zellen nach 24 und 48 h bewertet wurde, in der Kontrolle (nicht-stimulierte ) und Testgruppen (stimuliert mit Pg
LPS und Ec
LPS). Es gab keinen Unterschied in Zellen Lebensfähigkeit mit den verwendeten Stimuli nach 24 und 48 h (Figur 2). Abbildung 2 Zellen Lebensfähigkeit. Fibroblasten Lebensfähigkeit in Frage gestellt mit Pg
LPS und Ec
bei 24 und 48 Stunden ausgewertet LPS in der Kontrolle (nicht-stimulierten) und Testgruppen (stimuliert mit Pg
LPS und Ec
LPS) durch MTT-Test .
Cytokines Sekretion Fibroblasten aus der Gaumenschleimhaut mit den marginalen Gingiva transplantierten Zellen verglichen
wenn die Ziele dieser Studie zwischen den beiden Subpopulationen von Fibroblasten verglichen wurden, war die IL-6-Sekretion signifikant statistisch nach 24 und 48 h von Pg
LPS-Stimulation (3A und B) von beiden Subtypen von Fibroblasten (aus der Gaumenschleimhaut und Gingivatransplantat in Randbereich) und die Differenz größer war mit 48 h (3B). Auf der anderen Seite war die Sekretion nach Ec
LPS Stimulation nur statistisch signifikant nach 48 h, die von beiden Subtypen von Fibroblasten (Figur 3D). Außerdem wurde IL-6-Sekretion durch größere nicht-stimulierten Fibroblasten vom Rand Gingivatransplantat (Abbildung 3). Abbildung 3 IL-6-Sekretion durch menschliche Fibroblasten aus Gaumenschleimhaut und marginal Gingivatransplantat. A-D: primäre Zellkulturen von periodontalen Geweben von drei gesunden Probanden erhalten wurden, und nach der vierten Passage wurden mit LPS von P. gingivalis
angeregt und von E. coli
in einer Konzentration von 1 & mgr; g /mL. Kulturmedium ohne Stimuli wurde als Kontrolle verwendet. ELISA wurde zur Quantifizierung der Cytokine an den Zellkulturüberständen durchgeführt. Repräsentative Figur des Durchschnitts der drei unabhängigen Experimenten, n = 3 * P & lt; 0,05 wurde signifikant unterschiedlich betrachtet. PMF = Palatin Schleimhaut Fibroblasten. GMF = marginale Gingivafibroblasten.
Fibroblasten aus der Gaumenschleimhaut mehr IL-8 /CXCL8 als Fibroblasten aus dem marginalen Gingivatransplantat sezerniert, wenn sie von Pg stimuliert
LPS mit einer statistisch signifikanten Unterschied bei 48 h (4A und B) . Auch in Bezug auf dieses Chemokin, Fibroblasten aus der Gaumenschleimhaut zeigte einen Anstieg bei den beiden 24 h und 48 h, wenn sie von Ec
LPS (4C und D) stimuliert, die nicht von Zellen aus dem marginalen Gingivatransplantat beobachtet wurde. Abbildung 4 IL-8 /CXCL8 Sekretion von humanen Fibroblasten gezüchtet aus Gaumenschleimhaut und marginal Gingivatransplantat. A-D: primäre Zellkulturen von periodontalen Geweben von drei gesunden Probanden erhalten wurden, und nach der vierten Passage wurden mit LPS von P. gingivalis
angeregt und von E. coli
in einer Konzentration von 1 & mgr; g /mL. Kulturmedium ohne Stimuli wurde als Kontrolle verwendet. ELISA wurde zur Quantifizierung der Cytokine an den Zellkulturüberständen durchgeführt. Repräsentative Figur des Durchschnitts der drei unabhängigen Experimenten, n = 3 * P & lt; 0,05 wurde signifikant unterschiedlich betrachtet. PMF = Palatin Schleimhaut Fibroblasten. GMF = marginale Gingivafibroblasten.
In dieser Studie, MIP-1α /CCL3 beobachtet wurde konstitutiv von beiden Fibroblasten-Subtypen (Abbildung 5) ausgeschieden werden. Darüber hinaus gab es keinen statistisch signifikanten Unterschied in der MIP-1α /CCL3 Sekretion zwischen unstimulierten Fibroblasten (Kontrollgruppe) und mit Pg oder in Ec stimulierte Fibroblasten
LPS aus der Gaumenschleimhaut (Abbildung 5). Allerdings statistisch signifikanter Unterschied wurde in MIP-1α /CCL3 Sekretion beobachtet nach 48 h, wenn Fibroblasten aus dem marginalen Gingivatransplantat mit Pg stimuliert wurden
LPS (5B) und nach 24 h, wenn sie von Ec
LPS in Frage gestellt (Abbildung 5C). Abbildung 5 MIP-1α /CCL3 Sekretion von humanen Fibroblasten gezüchtet aus Gaumenschleimhaut und marginal Gingivatransplantat. A-D: primäre Zellkulturen von periodontalen Geweben von drei gesunden Probanden erhalten wurden, und nach der vierten Passage wurden mit LPS von P. gingivalis
angeregt und von E. coli
in einer Konzentration von 1 & mgr; g /mL. Kulturmedium ohne Stimuli wurde als Kontrolle verwendet. ELISA wurde zur Quantifizierung der Cytokine an den Zellkulturüberständen durchgeführt. Repräsentative Figur des Durchschnitts der drei unabhängigen Experimenten, n = 3 * P & lt; 0,05 wurde signifikant unterschiedlich betrachtet. PMF = Palatin Schleimhaut Fibroblasten. GMF = marginale Gingivafibroblasten.
Wenn TGF-β-Sekretion bewertet wurde, Fibroblasten aus der Gaumenschleimhaut zeigte keine nachweisbaren Mengen auch in Gegenwart von Pg
LPS (6A und B) oder Ec
LPS (Abbildung 6C und D). Im Gegenteil zeigte Fibroblasten vom Rand Gingivatransplantat eine konstitutive TGF-β-Sekretion und es gab keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen stimulierten und nicht stimulierten Zellen, die beide bei 24 h und 48 h (Figur 6). VEGF und CXCL16-Sekretion wurde nicht erkannt entweder auf Fibroblasten Überstand kultiviert aus der Gaumenschleimhaut weder von der marginalen Gingiva, unabhängig Stimulation von Pg oder in Ec
LPS. 6 TGF-β-Sekretion durch menschliche Fibroblasten aus Gaumenschleimhaut und marginal Gingivatransplantat. A-D: primäre Zellkulturen von periodontalen Geweben von drei gesunden Probanden erhalten wurden, und nach der vierten Passage wurden mit LPS von P. gingivalis
angeregt und von E. coli
in einer Konzentration von 1 & mgr; g /mL. Kulturmedium ohne Stimuli wurde als Kontrolle verwendet. ELISA wurde zur Quantifizierung der Cytokine an den Zellkulturüberständen durchgeführt. Repräsentative Figur des Durchschnitts der drei unabhängigen Experimenten, n = 3 * P & lt; 0,05 wurde signifikant unterschiedlich betrachtet. PMF = Palatin Schleimhaut Fibroblasten. GMF = marginale Gingivafibroblasten.
Diskussion
Fibroblasten sind nicht eine einzigartige Zellgruppe über die verschiedenen anatomischen Regionen [9, 22-24]. Sie sind die vorherrschenden Zellen in periodontal Bindegewebe [12], und in der Immunantwort des Wirts durch Freisetzung inflammatorischer Cytokine [7] und Reparatur Mediatoren beteiligt sind [25, 26]. Nach bestem Wissen des Autors, ist dies die erste Studie zu untersuchen und das Profil von Vermittlern Sekretion durch menschliche Fibroblasten aus nicht marginal Gaumenschleimhaut mit dem marginalen Gingiva transplantierten Gewebes zu vergleichen, was auf die Unterschiede oder Ähnlichkeiten zwischen diesen Zellen in einen Beitrag für Zytokine Sekretion auf bakterielle LPS-Stimulation.
In der vorliegenden Studie wurde festgestellt, dass beide von Gaumenschleimhaut und marginal Gingivatransplantat abgeleiteten Fibroblasten sezerniert IL-6 Zytokin ähnlich stimuliert, wenn sie von Pg oder in Ec
LPS. Wir erkennen, dass es wertvoll gewesen wäre mRNA-Expression zu untersuchen, um besser zu verstehen, ob Transkriptniveaus zwischen ihnen unterschiedlich sein würden. Dies könnte uns einige Informationen über mögliche posttranskriptionellem Modifikationen, die Produktion von Zytokinen verändern kann. Frühere Studien [8, 14, 15, 27, 28] haben gezeigt, dass auf eine bakterielle Stimuli wie LPS ausgesetzt Fibroblasten signifikante IL-6-Expression zeigte, was die Bedeutung dieses Zytokins in der Wirts Immun- und Entzündungsantwort bei Parodontitis, aber die vorliegende Untersuchung ergab auch IL-6-Sekretion für beide Subtypen von Fibroblasten auf 48 h erhöht. Hier war IL-6-Sekretion durch konstitutive unstimulierten Zellen aus der Gaumenschleimhaut und auch von der Rand Gingivatransplantat, statistisch signifikant sind für die letztere. Scheres et al. [14] zeigten, dass nicht-stimulierten Gingivafibroblasten ausgedrückt und IL-6 als Desmodonts Fibroblasten sezerniert wird. Dies deutete darauf hin, dass Gingivafibroblasten einen höheren Aktivitätszustand haben, weil sie anfälliger für haben Kontakt mit Parodontalpathogenen sind und hier zeigen wir diese wichtige Rolle für beide Subtypen Gingivazellen.
Es wird hier gezeigt, dass Fibroblasten aus der Gaumenschleimhaut nur sekretierten IL-8 /CXCL8-Chemokin, als mit bakterieller LPS stimuliert. Als diese Zellen auf dem gingivalen Randbereich gepfropft, nach 4 Monaten IL-8 /CXCL8-Chemokin-Sekretion auch in Abwesenheit von LPS Stimuli beobachtet wurde. Diese Änderung in der Expressionsprofil kann an dem engeren Kontakt der Zellen mit bakteriellen Virulenzfaktoren wie Pg
LPS, auf dem Rand Parodontiums bezogen werden. Frühere Studien [9, 13-15, 29] haben gezeigt, dass durch Pg
LPS stimulierten Fibroblasten können zur Herstellung IL-8 und Fibroblasten aus unterschiedlichen anatomischen Regionen zeigen Heterogenität auf Chemokin-Profil-Sekretion [14]. Daher hebt es ferner, dass die heterogene Sekretion von IL-8 /CXCL8 in der aktuellen Studie des Umwelteinflusses auf die Sekretion von Fibroblasten-Mediatoren auf einen neuen anatomischen Bereich gepfropft aufgetreten sein können, in denen Anpassung und die Proliferation dieser Zellen ist.
wenn das Chemokin MIP-1α /CCL3 untersucht wurde, wurde beobachtet, daß bei Fibroblasten aus der Gaumenschleimhaut auf den Randbereich gingival gepfropft wurden, sie ähnliche Zytokin konstitutive Sekretion in der Abwesenheit von bakterieller Stimulation aufrechterhalten. Allerdings Fibroblasten aus dem marginalen Gingivatransplantat zeigten eine höhere Sekretion im Vergleich zu Fibroblasten aus der Gaumenschleimhaut erst nach 48 h, wenn sie von Pg
LPS stimuliert, eine zeitabhängige Expression zeigt. Auch hier könnte die erhöhte Chemokin-Sekretion, in diesem Fall MIP-1α /CCL3, durch Fibroblasten aus der marginalen Gingiva Transplantats aufgrund von Zahnbelag in den Sulcus im Randbereich der vorherigen Stimulations aufgetreten, was nahe legt, dass diese Zellen ein adaptives Verhalten vorhanden, wenn auf den Zahnfleischsaum gepfropft. Eine frühere Arbeit unserer Gruppe [9] zeigten, dass gingivalen und Desmodonts Fibroblasten auf MIP-1α /CCL3 Sekretion anders verhalten, wenn sie von Pg
LPS stimuliert und zeigten auch eine erhöhte MIP-1α /CCL3 Sekretion, wenn die Zellen in Frage gestellt wurden durch Pg
LPS in geringen Konzentrationen wie 0,1 ug /ml, die im Laufe der Zeit erhöht.
in Bezug auf TGF-β-Sekretion, kultivierten Fibroblasten aus der Gaumenschleimhaut und der marginale Gingivatransplantat ein heterogenes Verhalten zeigte. Fibroblasten aus der Gaumenschleimhaut zeigte nicht TGF-β-Sekretion auch gegen die bakterielle Reize angewendet. Im Gegenteil, Fibroblasten vom Rand Gingivatransplantat TGF-β sezerniert, ohne irgendeinen Unterschied zwischen stimulierten und nicht-stimulierten Zellen. Eine Studie [30] zeigten, dass Fibroblasten aus Desmodonts ausgedrückt TGF-β, aber seine Produktion wurde nicht durch bakterielle LPS betroffen, was darauf hindeutet, dass TGF-β bei Entzündungen akkumulieren die zelluläre Immunfunktion unterdrückt, aber ohne dass es zu Gewebezerstörung durch Stimulation mit bakteriellem LPS. Eine andere Studie fand Desmodonts und gingivalen Zellen [8] zu vergleichen, dass TGF-β-Sekretion auf der Stimulus-Konzentration abhing, die hauptsächlich für gingival Fibroblasten, höher zu sein, wenn sie mit 10 ug /ml LPS herausgefordert, während die Konzentration von 1 ug /ml verwendete in der aktuellen Studie, zeigten keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zu den nicht-stimulierten Fibroblasten. Die erhöhte TGF-β Sekretion hier durch marginale transplantierten Zellen gefunden Reparatur von Gewebe zusammenhängen könnte und könnte durch die kontinuierliche Reparaturbedarf aufgetreten sind, da die ständige Präsenz von Zahn Sulcus Mikrobiota marginale Veränderungen hervorruft.
Schließlich sind die Ergebnisse zeigten, dass weder Fibroblasten aus der Gaumenschleimhaut noch von der marginalen Gingivatransplantat sezerniert VEGF noch CXCL16, entsprechend der verwendeten Stimuli. Frühere Studien [31, 32] haben gezeigt, dass menschliche gingival stimuliert Fibroblasten durch LPS, Vesikel und Proteine aus Pg
und Aa
extrazelluläre Membran konnten VEGF zu erzeugen, wenn durch solche Mittel stimuliert. Vielleicht in dieser Studie wird die Zeit und der Konzentration von LPS verwendet wurden, waren für die Induktion von VEGF nicht ausreichend. Bezug CXCL16, wurde berichtet, dass dieser Ausdruck von anderen Zytokinen wie IFN-γ und TNF-α und deren Sekretion vermittelt durch ADAM 10 Membranrezeptor, der Funktion CXCL16 induziert wurde auf entzündeten Geweben reguliert [33]. Eine weitere Arbeit [19] zeigten, dass die Expression durch CXCL16 gingivale Fibroblasten durch mehrere Cytokine wie IL-1β, TNF-α und IFN-γ kontrolliert wurde. In der Tat könnte man, dass CXCL16 Sekretion spekulieren nicht in der aktuellen Studie festgestellt wurde, weil Fibroblasten nur durch bakterielles LPS stimuliert wurden, und die Wirkung anderer Cytokine oder andere Stimuli können für die Sekretion von CXCL16 durch gingivale Fibroblasten [19, 33] erforderlich.
die heterogene Sekretion von Entzündungsmediatoren und Reparatur anzeigen kann, daß auf einen neuen anatomischen Region (Zahnfleischsaum) gepfropft Fibroblasten können diese Zellen in Kontakt mit bakteriellen Produkte von der Mikroumgebung im Moment beeinflusst werden, effektiver im Rahmen der beteiligten die Entzündungsreaktion.
Schlussfolgerungen
Fibroblasten aus der Gaumenschleimhaut ein adaptives Verhalten in Bezug auf Zytokine Sekretion präsentieren, wenn sie auf den Zahnfleischsaum gepfropft Unterschied in der Sekretion von wichtigen Entzündungsmediatoren auf die marginale Parodont Homöostase zeigt.
Abkürzungen
Pg:
Porphyromonas gingivalis
Ec:
Escherichia coli
ELISA :
Enzyme Linked Immuno Assay
LPS:
Lipopolysaccharide
DMEM:
Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium
FBS:
Fötales Rinderserum
FSP:
Fibroblast Oberflächenprotein
BSA:
Rinderserumalbumin
DAPI:
49,6-diamidino-2-phenylindol
DMSO:
Dimethylsulfoxid
MTT:. Cover: [3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid
Erklärungen
Acknowledgments
Es gibt keine Interessenkonflikte mit dieser Studie verbunden. (; Zuschuss # 2010 /01230-1 zu CFS FAPESP) und vom Nationalen Rat für wissenschaftliche und technologische Entwicklung (CNPq; gewähren # 480160 /2013-9 zu CFS) Autoren 'Original vorgelegt Dateien für Bilder Was sind unten, um die Links zu den Autoren ursprünglich eingereichten Dateien für Bilder. 12903_2013_366_MOESM1_ESM.tif Autoren Originaldatei für Abbildung 1 12903_2013_366_MOESM2_ESM.tif Autoren Originaldatei für Abbildung 2 12903_2013_366_MOESM3_ESM.tif Autoren Originaldatei für Abbildung 3 12903_2013_366_MOESM4_ESM.tif Autoren Originaldatei für Abbildung 4 12903_2013_366_MOESM5_ESM.tif Originaldatei 'Autoren für Abbildung 5 12903_2013_366_MOESM6_ESM.tif Autoren Originaldatei für 6 Interessenkonflikt
die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Beiträge der Autoren
FPA, ACFM, CRS, CFS und Schlacken konzipiert und das Projekt geplant. Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.
