Zusammenfassung
Hintergrund
Karies ist die häufigste Menschheit beeinflussen mikrobiellen Krankheit. Caries Risikobewertungsmethoden, die Identifizierung von Biomarkern und die Entwicklung von Impfstoffen Strategien hervorgehoben werden, um die Inzidenz der weitgehend vermeidbaren Krankheit zu kontrollieren. Mustererkennung Rezeptoren wie die Maut like Rezeptoren (TLR) wurden als Modulatoren von Wirt-mikrobiellen Wechselwirkungen beteiligt. Lösliche TLR-2 und seine Co-Rezeptor, CD14 im Speichel identifiziert wurden, können die Zellwandkomponenten von kariogenen Bakterien binden und den Krankheitsprozess zu modulieren. Das Ziel dieser Studie ist es, das Potenzial der Speichel STLR-2 und sCD14 als Biomarker der Kariesaktivität und indirekte Maßnahmen der kariogen bakterielle Belastung zu bestimmen.
Methoden
Nichtstimulierte ganze Speichel von zwanzig kariesfreien und zwanzig Karies gesammelt aktive Kinder im Alter zwischen 5 und 13 Jahren. Die Konzentration von sCD14 und STLR-2 zusammen mit der des Zytokins IL-8 berichtet in Zahnkaries durch das Enzym linked immunosorbent assay beurteilt wurde erhöht werden.
Ergebnisse
während das Niveau der sCD14 und der IL- 8 war nicht eindeutig zwischen den beiden Gruppen, die STLR-2-Konzentration in Karies aktiv Speichel als signifikant höher war in kariesfreien Speichel.
Schlussfolgerungen
der STLR-2 im Speichel als potenzielle Biomarker für die Kariesaktivität dienen könnte.
Schlüsselwörter Saliva Lösliche Maut like Rezeptor 2 Zahnkaries Biomarkern elektronische ergänzendes Material
Die Online-Version dieses Artikels (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-108) enthält zusätzliches Material, welches durch komplexe Wechselwirkungen zwischen den säureproduzierenden Bakterien, vergärbaren Kohlenhydraten und Wirtsfaktoren ist für autorisierte Benutzer zur Verfügung.
Hintergrund
Zahnkaries eine multifaktorielle Infektionskrankheit verursacht wird. Trotz weitgehend vermeidbar ist, bleibt sie als die am weitesten verbreitete chronische Krankheit weltweit [1]. Neuere systematische Analysen deuten darauf hin, dass die Häufigkeit von Karies zeigt eine steigende Tendenz bei Kindern im Alter von 2-4 Jahren in den Vereinigten Staaten [2]. Es gibt Hinweise auf eine erhöhte Prävalenz bei Erwachsenen in niedrigeren sozioökonomischen Status in den europäischen Ländern. In den Entwicklungsländern die Prävalenz steigt sowohl bei Kindern und Erwachsenen [3].
Früherkennung von Weiß-Spot-Läsionen, Entmineralisierung verhaften und Remineralisierung fördern sind nur einige der präventiven klinischen Methoden, die derzeit in der Zahnkariesmanagement [4]. Darüber hinaus wird großen Wert auf die Entwicklung effizienter Kariesrisikobewertungsstrategien gelegt, die Wahrscheinlichkeit eines individuellen Entwicklung neuer Kariesläsion und /oder zur Bestimmung des Status des Karies-Prozess auf einzelnen Zahnoberflächen [4, 5] zu bestimmen. Als Krankheit der mineralisierten Gewebe der Zähne, Pathogenese von Karies beinhaltet durch säurebildenden Bakterien und Zerstörung der organischen Substanz Entmineralisierung des Zahnschmelzes in Kavitation resultierende [1, 4].
Saliva ist als eine reiche Quelle von Wirtsfaktoren erkannt fähig von den Kariesprozess zu modulieren [6, 7]. Technologische Fortschritte haben in der Charakterisierung von Speichel Proteomik und Peptidomik mit der Identifizierung von 1444 Proteine und Peptide 11893 bzw. [8] unterstützt. Diese Protein /Peptide gehören zu verschiedenen funktionellen Klassen, wie die in Reaktion beteiligt Stimulus /Belastung, antioxidative Funktionen, katalytischen Funktionen und Enzymregulatoren [8, 9]. Mehrere Speichel Komponenten wurden für einen Zusammenhang mit Zahnkaries beurteilt. Während einige zeigen schwache Assoziation, andere waren nicht eindeutig zwischen normalen und Karies aktiv Speichel [9-12]. Beurteilung der Speichel Glykoproteine mit spezifischen Oligosaccharide zeigte, dass eine höhere Auswahl Oligosaccharid, das an der Oberfläche der Zähne bakterielle Besiedlung erleichtern mit Karies Inzidenz bei jungen Erwachsenen korrelieren [13]. Speichel- Ebenen von antimikrobiellen Substanzen wie alpha-Defensine, Statherin und Cystatin S als potenzielle Risikofaktoren für Karies Entwicklung [10, 14].
Toll-like-Rezeptoren (TLR) sind Keimbahn kodiert Rezeptoren vorgeschlagen worden, die typischerweise konservierte mikrobielle Muster erkennen durch große Gruppen von Mikroorganismen geteilt. Derzeit 13 Säugetier TLR und viele ihrer Liganden sind bekannt [15]. Funktionierende entweder alleine oder gemeinsam mit spezifischen Co-Rezeptoren bei der Erkennung mikrobiellen Muster der TLRs wirken als Torwächter ständig die Umwelt Probenahme und entlocken Antworten zur Verhinderung /Kontrolle Infektion [15, 16]. TLR-2 und TLR-4 wurden die Peptidoglycan von grampositiven und das Lipopolysaccharid der Gram-negativen Bakterien zu erkennen, gezeigt jeweils entweder allein oder in Verbindung mit dem gemeinsamen Co-Rezeptor CD14 [17, 18]. Odontoblasten am Dentin-Pulpa Oberfläche lokalisiert in gesunde Zähne wurden TLR-2 und TLR-4 gezeigt auszudrücken. In Abhängigkeit von der Natur der Reaktion Odontoblastenfortsätze caries Progression entweder mit der Bildung von Dentin reaktionäre unterdrückt oder beschleunigt führende Entzündung Pulpa [19, 20]. Mikrobielle Invasion von Dentin wurde TLR-4 gezeigt hinaufzuregulieren in Odontoblasten und TGF-β Sekretion erleichtern Kollagensynthese vermitteln. Darüber hinaus TLR-4 Signalisierung in Odontoblasten auch Matrix-Metalloproteinase-2 Förderung der Spaltung von Dentin sialophosphoprotein (DSPP) Zahn Sialoproteins (DSP) upregulate, die in der neu gebildeten Kollagen eine Keimstelle für hydroxyapeptite Kristallbildung bildet [19]. Stimulation von odontoblast wie Zellen mit Zellwandbestandteilen von Gram-positive Bakterien ausgelöst Zytokin und Chemokin Sekrete in einem TLR-2 abhängigen Weise [20]. Erhöhte Spiegel von Cytokinen IL-6, TNF-α und IL-8 wurden in caries aktiven Speichel [21] beobachtet.
Während hauptsächlich membranassoziiertes kürzlich lösliche Formen bestimmter TLR haben in Körperflüssigkeiten identifiziert wurden. Es wurde vorgeschlagen, daß die löslichen TLR funktionieren Pathogene zu maskieren [22-25]. Vor kurzem haben wir und andere Gegenwart löslicher sCD14 und STLR-2 berichtet in Speichel [24, 26]. TLR-2 hat sich gezeigt, das Peptidoglykan und die lipotechoic Säure von Streptococcus mutans zu erkennen
, sind die häufigsten kariogenen Bakterien [27]. Erhebliche Anzeichen dafür, eine starke Korrelation zwischen der erhöhten Anwesenheit von kariogenen Bakterien in der Plaque Biofilm und erhöhten Anzahlen der gleichen Bakterien im Speichel [6, 10]. Daher nahmen wir an, dass das Niveau von STLR-2 und sCD14 im Speichel von Karies aktiven Personen wird ein indirektes Maß für die bakterielle Belastung und wirken als Biomarker für die Kariesaktivität ergeben. Unsere Daten deuten darauf hin, dass die STLR-2 ist höher in der unstimulierten ganze Speichel (UWS) der Kinder mit aktiven Kariesläsionen.
Methoden
Studienpopulation
In dieser prospektiven, nicht-randomisierten klinischen Studie vierzig Kinder zwischen 6 und 12 Jahren zu den Kinderkliniken der University School of Dentistry Indiana Berichterstattung wurden nach Erhalt informierte Einwilligung der Patienten und Vormund rekrutiert. Die Studie wurde von der Institutional Review Board der Indiana University Purdue University in Indianapolis genehmigt. Die Proben wurden nur ohne bekannte orale oder systemische Erkrankung anders als Zahnkaries und keine extrahierten Zähnen von Kindern gesammelt. Mündliche Prüfungen von Kindern durchgeführt wurden und Kariesaktivität aufgezeichnet. Zwanzig Kinder (13 Jungen und 7 Mädchen) waren kariesfrei und zwanzig Kinder (12 Jungen und 8 Mädchen) waren Karies aktiv vier vor acht kariöse Läsionen aufweisen, erfordern die Restaurierung.
Probensammlung und Verarbeitung
Alle Kinder wurden angewiesen, zu vermeiden mindestens 2 Stunden vor der Speichelentnahme zu essen und zu trinken für so beschrieben [24, 28]. Nach dem Spülen des Mundes kurz mit Wasser, nicht stimulierte ganze Speichel (UWS) wurde in vorgekühlte Röhrchen für fünf Minuten von jedem Kind durch die passive sabbern Methode gesammelt. Die Proben wurden auf Eis ins Labor sofort zur Weiterverarbeitung transportiert. Jede Probe durch Zentrifugieren bei 4000xg bei 4 ° C in drei Aliquots geklärt wurde in CompleteTM Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Mannheim, Deutschland) bis zur weiteren Analyse.
Gesamtproteinkonzentration
bei -80 ° C für 10 min und gespeichert der Gesamtproteingehalt von pre Proben wurde durch das Bradford-Verfahren gemessen, die an die Proteine von Commassie-blau-Farbstoff beinhaltet Bindung [24, 25]. Die blaue Protein-Farbstoffform wurde bei 595 nm unter Verwendung von Spektrophotometer (Gensys5 Spektrophotometer, thermoelektronischen corp, CA) nachgewiesen. Die Konzentration des Proteins in jeder Probe wurde gegen eine Standardkurve bestimmt, entwickelt unter Verwendung bekannter Konzentration von Rinderserumalbumin
Enzym-Immunosorbent-Assay (ELISA) verbunden
Für sCD14 in Speichel ein Sandwich-ELISA-Kit (R & amp bestimmen;. D Systems , Minneapolis, wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers MN) verwendet. Anti-human TLR-2 polyklonale Antikörper (Klon: IMGENEX Corporation, San Diego, CA) wurde für die Detektion von TLR-2 verwendet. Alle UWS Proben wurden von Amylase und Immunglobuline verarmt durch seriell mit Anti-Human-Amylase monoklonalen Antikörper (mAb) Inkubation (1: 2500, Katalog # ab8944; Abcam, Cambridge, MA, USA) und Protein G-Kügelchen (Miltenyi Biotec Inc. Auburn, Kalifornien ) bei 4 ° C [24]. Der Proteingehalt der vorgereinigten Proben wurde wie oben bestimmt und vorgereinigten HWL bei 1 & mgr; g /ml Konzentration verwendet wurde zur Messung sCD14 und STLR-2-Spiegel [25]. Vorinkubation der HWL mit entweder Anti-TLR2 mAb (Klon: 1030A5.138, Imgenex Corp, San Diego, CA, USA) (0,5 & mgr; g /ml) oder mit TLR-2-Peptide (1 & mgr; g /ml) durchgeführt, die zu bewerten Spezifität der Bindung. Gebundenen CD14 und TLR-2 wurde mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiertem anti-Maus-IgG, gefolgt von TMB-Substrat (Pharmingen, San Diego, CA) nachgewiesen. Extinktion bei 450 nm wurde in einem Mikroplattenleser (: Biorad Laboratories, CA Modell 680) gelesen. Die Konzentration von STLR-2 oder sCD14 in pg /ml Speichelproteine wurde unter Verwendung einer Standardkurve von gereinigtem rekombinanten humanen CD14Fc und TLR-2fc bestimmt (R & amp; D Systems) bekannter Konzentration. IL-8-Konzentration in den geklärten Speichelproben wurden gemessen unter Verwendung von BD OptEIA3 ™ ELISA-Kit.
Wurden statistische Analyse
Unterschiede in der Konzentration von IL-8, CD14 und TLR-2 zwischen den kariesfreien und Karies aktiven Gruppen bestimmt von Students 't-Test. p-Wert von weniger als 0,05 wurde als signifikant angesehen.
Ergebnisse und Diskussion
Trotz der Fortschritte bei der Früherkennung Methoden und effiziente Präventionsmaßnahmen Karies bleibt eine sehr weit verbreitete chronische Krankheit weltweit. Die zunehmende Inzidenz bei Kindern in den entwickelten Ländern stellt eine beunruhigende Gesundheit betreffen [2, 3]. Die demographischen Details der Studienpopulation sind in Tabelle 1 die Gesamtproteinkonzentration von humanem Speichel gezeigt aufzuweisen wurde Bereich große Variationen gegeben von 0,4 mg /ml bis 7,1 mg /ml [29, 30]. In unserer Studie Kohorte 6,24 +/- 1,98 mg /ml in kariesfreien Speichel und 5,92 +/- 2,37 mg /ml in Karies aktiv Speichel (Abbildung 1A) .Tabelle 1 Die demographischen Daten der Studienpopulation der Gesamtproteinkonzentration
Klinische Daten
Anzahl rekrutiert
Alter (Jahre)
männlich
weiblich
Zahnkaries
12
8
8,76 +/- 3,42
Gesunde Kontrolle
13
7
7,77 +/- 2,7
Abbildung 1 Gesamtproteinkonzentration im Speichel: Geklärte ganze Speichel für (A) Gesamtproteingehalt spektrophotometrisch bewertet wurde und (B ) IL-8-Konzentration durch ELISA. War kein signifikanter Unterschied zwischen den kariesfreien und den Karies aktiv Speichel Gruppen.
Um die zunehmende Zahl von Speichelproteinen beobachtet werden, um die löslichen Formen von Mustererkennungsrezeptoren, die STLR-2, sCD14 und STLR-4 [25, 26 hinzugefügt , 31]. Die Konzentration von STLR-2 in Parotisspeichel wurde mehrere Falten höher als im gesamten Speichel [31] zu sein, berichtet. Die Quelle der STLR-2 könnte entweder aktive Sekretion aus der Drüse und /oder ein Ergebnis von extrazellulären Spaltung des membrangebundenen Rezeptors sein. Wir beobachteten, dass die Konzentration von STLR-2 in Karies aktiv Speichel (29,5 +/- 3 pg /ml) war signifikant höher als bei kariesfreien Speichel (24,8 +/- 0,6 pg /ml) (2B). Signalisierung über TLRs in Wirtszellen induziert Zytokinsekretion [15]. Zuvor Gornowicz et al., Haben erhöhte Spiegel von IL-8 Speichel berichtet in Zahnkaries [21]. Wir beobachteten, dass die Speichel IL-8-Konzentration nicht signifikant frei und Karies aktiv Speichel (Abbildung 1B) zwischen Karies unterschieden. Die variable Beobachtungs zwischen den beiden Studien konnten die Unterschiede im Alter und der Art der Probe zugeschrieben werden (Amylase und Ig abgereicherten vs. nicht verarmten). Die Konzentration von sCD14 in Speichel war in beiden Gruppen nicht eindeutig; im Bereich zwischen 509 pg /ml und 1443 pg /ml in der freien Gruppe Karies und zwischen 609 pg /ml und 1829 pg /ml in Karies aktive Gruppe (2A). Zuvor Bergandi et al., Berichtet völlige Fehlen von sCD14 im Speichel bei Kindern mit zwei vor acht kariöse Läsionen [28]. Die Verwendung von vorgereinigte Speichel und der verwendeten Methode für sCD14 (Western Blot gegen Sandwich-ELISA) messen konnte Attribut auf die beobachteten Unterschiede zwischen dem Bericht und Bergandi unserer Studie. Figur 2 sCD14 und STLR-2-Konzentration im Speichel: Geklärte Speichel wurde der hochmolekularen Proteine abgereichert reichlich, Amylase und Immunglobuline, wie in dem Abschnitt Verfahren beschrieben, um die Empfindlichkeit zu erhöhen des Erfassens von weniger reichlich und sCD14 STLR-2. Die Höhe der (A) sCD14 und (B) STLR-2 wurde durch ELISA bestimmt. * Steht für p & lt; 0,05.
Mit Karies auf seine starke Assoziation Basierend Inzidenz mehrere Studien Speichelniveaus S. mutans
zur Kariesrisikoprognose mit unterschiedlichen Ergebnissen ausgewertet [1, 32]. Die polymicrobial Ätiologie von Zahnkaries sowie die Wechselwirkung zwischen Speichelproteinen und S.mutans
der Variabilität beitragen könnten [30, 33]. Vier Haupttypen von Speichelprotein-Mikroben-Interaktion wurden in vitro beobachtet. Dazu zählen die Aggregation, die Einhaltung, Hemmung /Zellzerstörung und Ernährung [33]. Es wird postuliert, dass der beobachtete Anstieg der STLR-2 in Karies aktiv Speichel einen Wirt Maßnahme darstellen kann die erhöhte Gram + ve kariogenen Bakterien zu bekämpfen. Dies deutet darauf hin, dass die Speichel STLR-2-Ebene eine effiziente Biomarker für die Kariesaktivität darstellen. Die große Variationsbreite in der STLR-2-Konzentration in caries aktiven Speichel in dem Ausmaß von Karies zurückzuführen sein könnte.
Schlussfolgerungen
Zahnkaries ist eine komplexe Erkrankung, die klinische Schwere der die auf der Wechselwirkung zwischen oralen Mikroben hängt, Verfügbarkeit von vergärbaren Kohlenhydraten und Wirtsfaktoren im Speichel. Dies macht Identifizierung von prädiktiven Risikofaktoren für die kariöse Prozess sehr schwierig [5, 6]. In diesem Bericht haben wir beobachtet, dass zwei lösliche Proteine, sCD14 und STLR-2, die an der mikrobiellen Wirts Schnittstelle wirken, sind in der Karies aktiv Speichel, modifiziert mit einem später eine potenzielle Biomarker für die Kariesaktivität darstellt. Zukünftige Studien werden die STLR-2 Ebenen mit den kariogen Bakterienzahl in Speichel korrelieren
Abkürzungen
UWS.
Nichtstimulierte ganze Speichel
TLR:
Toll-like-Rezeptor.
Erklärungen
Bestätigung
die Autoren der Unterstützung zur Verfügung gestellt, um Alyssa Zhao von der Indiana CTSI erkennen die Sommerforschungsprogramm zu vervollständigen.
Autoren Original vorgelegt Dateien für Bilder
Hier sind die Links zu den Original eingereichten Dateien für Bilder der Autoren. 12903_2014_443_MOESM1_ESM.tif Autoren Originaldatei für Abbildung 1 12903_2014_443_MOESM2_ESM.tif Autoren Originaldatei für Abbildung 2 Konkurrierende Interessen
Die Autoren erklären, dass sie keine Interesse haben
Beiträge der Autoren
AZ:. Alyssa ist ein hoher Schule College-Student, der die ELISA-Experimente im Rahmen des Sommer-Forschungsstipendienprogramm durchgeführt, das Projekt Seed, Co-gesponsert von der American Chemical Society und der Clinical Übersetzungen Sciences Institute Indiana. Sie schrieb auch den ersten Entwurf des Abschnitt "Hintergrund". CB: Corinne ist ein Bachelor-wissenschaftlicher Mitarbeiter, die Alyssa bei der Durchführung der ELISA-Experimente geholfen, mehr in die Datenanalyse. Sie aktiv an der Probenverarbeitung beteiligt. Sie nahm auch an Manuskript schriftlich. JC: Dr. Chin ist der Kinderzahnarzt und bei der Rekrutierung von Studienpopulation und Probensammlung unterstützt. MS: ist der leitende Ermittler das Projekt einschließlich des Erhalts der ethischen Genehmigungen, Versuchsplanung und Datenanalyse und Manuskripterstellung zu überwachen. Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.
