Zusammenfassung
Hintergrund
Entzündung in der Mundhöhle entsteht durch Dysregulation zwischen mikrobiellen Biofilm und dem Host-Reaktion. Zu verstehen, wie unterschiedliche Mundhygieneprodukte entzündliche Eigenschaften beeinflussen, ist für die Entwicklung neuer Produkte wichtig. Daher Schaffung eines robusten Wirt-Pathogen-Biofilm-Plattform, die neuartige orale Gesundheits Verbindungen Auswertung ist eine attraktive Option. Wir entwickelten deshalb ein Multi-Spezies-Biofilm-Co-Kultur-Modell, das die natürlich gewonnenen Polyphenol Resveratrol (RSV) und Gold-Standard Chlorhexidin (CHX) in Bezug auf Anti-Biofilm und entzündungshemmende Eigenschaften.
Methoden
Eine in zu bewerten vitro
Multispezies-Biofilm enthält, S. mitis, F. nucleatum, P. gingivalis
und A. actinomycetemcomitans
erstellt wurde eine krankheitsassoziierte Biofilm und die mündliche Epithelzelle in OKF6-TERT2 darzustellen. Zytotoxizität Untersuchungen wurden mit RSV und CHX durchgeführt. Multi-Spezies Biofilme wurden entweder mit entweder Molekül behandelt, oder alternativ Epithelzellen wurden mit diesen vor behandelten Co-Kultur Biofilm. Biofilm-Zusammensetzung wurde bewertet und Entzündungsreaktionen in einem Transkriptions- und Proteinebene quantifiziert.
Ergebnisse
CHX war toxisch für Epithelzellen und Multispezies-Biofilme in Konzentrationen im Bereich von 0,01 bis 0,2%. RSV hat Effekt nicht Multispezies-Biofilm Zusammensetzung, war aber toxische Zellen bei Konzentrationen von mehr als 0,01% bis epithelialen. In Co-Kultur führte CHX behandelten Biofilme Down-Regulation des entzündungsfördernde Chemokin IL-8 an beiden mRNA und Protein-Ebene. RSV-behandelte Epithelzellen in Kokultur wurden herunterreguliert in der Freisetzung von IL-8-Protein, nicht jedoch mRNA.
Schlussfolgerungen
CHX potente bakterizide Eigenschaften besitzt, die stromabwärts Entzündungsmediatoren beeinflussen können. RSV scheint nicht bakteriziden Eigenschaften gegen Multi-Spezies-Biofilmen zu haben, jedoch hat es Epithelzellen durch die Freisetzung Entzündungsmediatoren unterdrücken scheinen. Diese Studie zeigt das Potenzial, die Mechanismen, durch die verschiedenen Mundhygieneprodukte beeinflussen können Zahnfleischentzündungen zu verstehen, wodurch die Verwendung eines Co-Kulturmodell Biofilm zu validieren.
Schlüsselwörter Parodontose Biofilm Epithelzelle elektronische ergänzendes Material
die Online-Version dieses Artikels (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-80) enthält zusätzliches Material, das autorisierten Benutzern zur Verfügung
Hintergrund
parodontale Erkrankung tritt aus einer Dysregulation zwischen dem Bakterien. Biofilm am Zahnfleischsaum und die Immunantwort sowohl in irreversible Zerstörung von weichen und harten Geweben ergebenden die Zähne trägt, schließlich zu Zahnverlust führt. In Gesundheit, angeborenen und adaptiven Immunmoleküle vermitteln das Gleichgewicht zwischen dem Host und den vorwiegend grampositive heterogene Bakteriensuspensionen im Speichel und anhaftenden Biofilm Gemeinden auf weichen und harten Gewebeoberflächen überall in der Mundhöhle. In Parodontitis führt die Verschiebung in der Mikrobiota von grampositiven negativen Spezies Gram Reaktion auf eine Dysregulation der Host sowohl von lokalen Geweben und Immunzellen, die an der Wurzel Entzündung und schafft eine Nische induziert für die anaerobe Spezies, um zu überleben weiter die Krankheit verschlimmert [1 ].
Zahlreiche prokaryote Arten sind in komplexen Biofilm Ökosystemen bestehenden entweder als supra- oder subgingivale Plaque innerhalb der Mundhöhle identifiziert. Viele von ihnen sind unkultiviert und ungenannten, aber alle spielen wichtige strukturelle und funktionelle Rolle [2]. Microarray und Sequenzierung der nächsten Generation Studien der mündlichen Mikrobiota hat erlaubt Klassifizierung von einigen Arten von Bakterien in Komplexe auf Basis von Assoziationen mit Gesundheit und Krankheit [3, 4]. Diese ermöglichten Studien Arten zu untersuchen, wie die krankheitsassoziierte Bakterien Porphyromonas gingivalis
, und zu verstehen, ihre Rolle bei der Anfechtung der Host-Reaktion [5]. Allerdings orale Biofilme sind komplexe und innerhalb dieser polymikrobiellen Biofilm Strukturen eine Vielzahl von intimen Interaktionen auftreten, was es schwierig macht, die genauen Auslöser für die pathogenen Ergebnisse mit Immundysregulation assoziiert zu beschreiben. Daher mit mehreren ein vereinfachtes Modell zu schaffen dieser wichtigen Krankheitserregern ist ein attraktives Angebot Wirt-Pathogen-Interaktionen und Test Wirkstoffe zur Behandlung Potenzial zu bewerten
Behandlung von Parodontitis ist schwierig. Zahnärzte führen debridement auf die Zähne, die Verabreichung von antimikrobiellen Mundspüllösungen Biofilmen und in fortgeschrittener Parodontitis, Chirurgie zu zielen. Allerdings Erfolge der Behandlung sind variabel und auf individueller Basis und Biofilm Zusammensetzung darauf hindeutet, kann das Ergebnis der Behandlung beeinflussen [6]. Antimikrobielle Mundspüllösungen derzeit eingesetzt, um oralen Erkrankungen verwalten umfassen eine Vielzahl von Verbindungen mit Chlorhexidin (CHX) der "Goldstandard" betrachtet wird wegen seiner bakteriziden und bakteriostatischen Eigenschaften [7]. Zusätzlich, Polyphenole, gefunden natürlich vorkommende in Pflanzen wie Trauben ein Fokus für die orale Therapien haben sich aufgrund ihrer entzündungshemmenden und antibakterielle Eigenschaften, [8]. Resveratrol (RSV) ist ein natürlich abgeleitet Polyphenol, die stark entzündungshemmende Eigenschaften in einer Vielzahl von Krebszellen und vor kurzem bei Ratten Parodontitis haben gezeigt worden ist [9, 10].
Beide CHX und RSV haben wünschenswerte Eigenschaften für Parodontitis Prävention, wobei antimikrobielle oder entzündungshemmende und antimikrobielle, respectively. Das Ziel dieser Studie war es daher ein Multi-Spezies-Biofilm-Modell zu erstellen und zu validieren in Co-Kultur mit Host-Epithelzellen, um die Wirkstoffe CHX und RSV, um zu testen, verwendet werden, um zu überprüfen, ob das Modellsystem als ein verwendet werden könnte, sensitive Methode ihrer grundlegenden Wirkungsweisen abgrenzen. Hier berichten wir, dass orale Epithelzellen eine reproduzierbare proinflammatorische Reaktion auf unsere Multispezies-Biofilm sowohl auf Gen- und Proteinebene erzeugen. Zusätzlich kann die Behandlung entweder Epithelzellen oder Multi-Spezies-Biofilmen mit Aktiv führte zu einer Veränderung der Entzündung innerhalb der Co-Kultur-Modell.
Methoden
Wachstum und Standardisierung von Bakterien
Porphyromonas gingivalis
ATCC 33277, Fusobacterium nucleatum
ATCC 10953, actinomycetemcomitans Aggregatibacter
ATCC 43718 und Streptococcus mitis
ATCC 12261 im Verlauf dieser Studien verwendet wurden. P. gingivalis
ATCC 33277 und F. nucleatum
ATCC 10596 wurden bei 37 ° C in Schädler anaerobe Brühe (Oxoid, Cambridge, UK) für 2 Tage und 1 Tag, jeweils in einer anaeroben Kammer (85% N
2, 10% CO 2 und 5% H 2, [Don Whitley Scientific Limited, Shipley, UK]). A. actinomycetemcomitans
ATCC 43718 und Streptococcus mitis
ATCC 12261 bei 37 ° C gezüchtet wurden in tryptischer Sojabrühe (Sigma, Poole, UK) mit 0,8% ergänzt w /v Glucose (BDH, Poole, UK) und 0,6 % w /v Hefeextrakt (Oxoid, Cambridge, UK) für 1 Tag in 5% CO 2. Die Bakterien wurden mit PBS gewaschen, dann normiert auf einen OD 550 von 0,2, mit Ausnahme von S. mitis
, die zu einer OD 550 von 0,5, etwa 1 × 10 zu erhalten, in einem Kolorimeter wurde standardisiert < sup> 8 KBE /ml jeder Bakterienarten auf ihren festgelegten Tag der Nutzung.
Wirkstoffe
Chlorhexidin (CHX [Sigma]) und Resveratrol (RSV [Sigma]) wurden in dieser Studie verwendet. CHX-Lösung wurde für die nachfolgende antimikrobiellen Tests bei 0,01, 0,05 und 0,2% v /v in Keratinozyten-serumfreiem Medium (KSFM) hergestellt und verwendet. RSV-Pulver wurde in ddH 2 O vor der Herstellung in KSFM bei 0,01, 0,05 und 0,5% v /v und für nachfolgende Zellstimulationsstudien.
Entwicklung von Multi-Spezies Biofilmen
Bakterien wurden standardisiert (1 solubilisiert × 10 7 cfu /ml) in künstlichem Speichel (AS), die die folgenden Bestandteile enthielt, wie zuvor beschrieben [11]. Diese enthalten Schweinemagen Mucinen (0,25% w /v), Natriumchlorid (0,35 w /v), Kaliumchlorid (0,02 w /v), Calciumchlorid-Dihydrat (0,02 w /v), Hefeextrakt (0,2 w /v), lab Lemco Pulver (0,1 w /v), Proteose-Pepton (0,5 w /v) in ddH 2 O (Sigma, Poole, UK). Harnstoff wurde dann zu, unabhängig zu einer Endkonzentration von 0,05% (v /v). Zur Einleitung Multispezies Biofilmentwicklung der Pionierarten S. mitis
Biofilm wurden zunächst für 24 h in 5% CO gebildet 2 auf 13 mm Durchmesser Thermanox ™ Deckgläser in 24-Well-Platten (Corning, NY, USA). Der Überstand wurde dann entfernt und F. nucleatum
zugegeben, die bei 37 ° C anaerob für weitere 24 h inkubiert. Der Überstand wurde entfernt und P. gingivalis Karten und A. actinomycetemcomitans
Zum dual Spezies Biofilm gegeben und bei 37 ° C anaerob für weitere 4 Tage inkubiert wurde, die als tägliche Ersetzen eines gemischten vier Arten Biofilm zu erzeugen, (1A). Abbildung 1 Entwicklung von Multi-Spezies-Biofilm-Co-Kultur-Modell. A. Multi-Spezies-Biofilm-Kultur-Protokoll. Thermanox ™ Deckgläser wurden in 24-Well-Platten für die Biofilmkultur gegeben. Die Bakterien wurden für 1-2 Tage auf geeigneten Agar-Platten und kultiviert in Brühe gezüchtet. Die Kulturen wurden dann dreimal in PBS gewaschen und bei 1 · 109 CFU /ml standardisiert, künstlicher Speichel zugesetzt, um eine 1 × 108 CFU /ml Endvolumen und zu dem Biofilm auf den entsprechenden Tagen und kultiviert in aeroben und anaeroben Bedingungen vorzunehmen. Nach 7 Tagen Kultur künstlichen Speichel aus reifen Biofilm entfernt, die dann mit PBS gewaschen und bei -80 ° C gelagert. B. Hängender Korb Co-Kultur-Modell. Multi-Spezies Biofilme wurden auf Thermanox ™ Deck gewachsen und zuvor beschrieben wurde. Epithelialen Zellen (OKF6-TERT2) wurden mit 1 × 105 Zellen /ml in Zellkulturmedium in 24-Well-Platten ausgesät. Biofilme wurden angebracht invers zu Millipore Zellkultureinsätze unter Verwendung Vaseline® und über Vertiefungen gegeben enthaltenden Zellen. Zellen und Biofilme wurden co-kultiviert für 4 bis 24 h. Die quantitative Analyse der Biofilm Zusammensetzung
Real-time quantitative PCR (qPCR)
wurde durchgeführt, dann die endgültige und die relative Zusammensetzung der Biofilme aufzuzählen. Kurz gesagt, bakteriellen Biofilmen wurden durch Beschallen in einem Ultraschallbad bei 35 kHz für 10 min entfernt, wie zuvor beschrieben [12]. Für qPCR wurde der Biofilm beschallen für die DNA-Extraktion unter Verwendung des MasterPure Gram Positive DNA Purificiation Kit (Epicentre®, Cambridge, UK) nach Anweisungen des Herstellers, mit der Modifikation verwendet, dass die Ultraschallbehandlungsprodukt für 4 h inkubiert Zelllyse zu gewährleisten. Die extrahierte DNA unterzog Qualitätskontrollen mit dem Nanodrop Spektralphotometer (Fischer Scientific, Loughborough). Kurz gesagt, 1 & mgr; l der extrahierten DNA mit einem Mastermix für jede Bakterienspezies 12,5 ul SYBR® Greener ™, 9,5 & mgr; l UV-behandelten RNase-freies Wasser und 1 & mgr; l von 10 & mgr; M Vorwärts /Rückwärts-Primer enthält, wurde hinzugefügt. Die verwendeten Primer wurden bisher veröffentlicht, wie in Tabelle 1 aufgeführt Drei unabhängige Replikate von jedem Parameter in dreifacher Ausfertigung mit MxProP Quantitative PCR-Maschine und MxProP 3000 Software (Stratagene, Amsterdam, Niederlande) wurden analysiert. Proben wurden quantifiziert, um die koloniebildenden Äquivalent (CFE) auf einen vorher festgelegten Standardkurve der Bakterienkolonie bildenden Einheiten im Bereich von 1 × 10 3 bis 10 8 cfu /ml zu berechnen. Die R 2 Werte für diese Standardkurven reichten von 0,956 bis 0,994. Die Schmelzkurvenanalyse wurde durchgeführt für alle Primer eine einzige Spitze, um sicherzustellen, setzt, der angibt, Primer-Spezifität war. Biofilm-Architektur wurde anschließend durch Rasterelektronenmikroskopie (SEM) analysiert. Hierzu Biofilm Proben wurden in PBS gewaschen, in 0,15 M Natriumcacodylat (pH 7,4) [13] in 2% Paraformaldehyd, 2% Glutaraldehyd, 0,15% w /v Alcianblau fixiert. Die festen und getrockneten Proben wurden durch Sputtern mit Gold beschichtet und unter einem JEOL JSM-6400 Rasterelektronenmikroskop betrachtet [14] .Tabelle 1 Primer für qPCR in dieser Studie verwendet
Gene
Vorwärts 5'-3 'Bei
Reverse-5'-3'
Referenz
Cytokine
IL-8
CAGAGACAGCAGAGCACACAA
TTAGCACTCCTTGGCAAAAC
[15]
GAPDH
CAAGGCTGAGAACGGGAAG
GGTGGTGAAGACGCCAGT
[15]
Bakterienspezies
S. mitis
GATACATAGCCGACCTGAG
CCATTGCCGAAGATTCC
[16]
F. nucleatum
GGATTTATTGGGCGTAAAGC
GGCATTCCTACAAATATCTACGAA
[17]
P. gingivalis
GCGCTCAACGTTCAGCC
CACGAATTCGCCTGC
[18]
A. actinomycetemcomitans
GAACCTTACCTACTCTTGACATCCGAA
TGCAGCACCTGTCTCAAAGC
[19]
Entwicklung eines epithelialen Biofilm Co-Kultur-Modell
OKF6-TERT2 Zellen (eine Art Geschenk des Rheinwald Labor, Krankenhaus Brigham und Frau , Boston) sind eine immortalisierte menschliche Mund Keratinozyten-Zelllinie [20] in diesen Untersuchungen verwendet wurde. OKF6 Zellen wurden in Keratinozyten-serumfreiem Medium (KSFM) wie zuvor beschrieben [21], kultiviert. Bei 90% Konfluenz wurden die Zellen trypsiniert, gewaschen in Hanks balancierter Salzlösung dann erneut ausgesät auf etwa 1 × 10 5 Zellen /ml und ausgesät auf eine Thermanox ™ Deckglas in einer 24-Well-Zellkulturplatte (Corning, NY, USA). Die Epithelzellen wurden gewaschen und dann Subjekt mit invertierter Biofilmen herauszufordern, angebracht Vaseline® zu hängen Zellkultur-Einsätze (Millipore, MA, USA), wie dargestellt in 1B verwendet wird. Die Biofilme auf den Thermanox ™ Scheiben wurden aus den Epithelzellen auf dem Boden des Bohrloches durch einen kleinen Raum von & lt getrennt; 0,5 mm, repräsentativ für eine Sulkus. Multispezies Biofilme wurden 4 und 24 h in der Co-Kultur-Modell inkubiert und die Lebensfähigkeit der Epithelzellen ± aktiven Behandlungen (CHX und RSV) ausgewertet, um eine metabolische Test von 10% v /v alamarBlue® Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers ( Life Technologies, Paisley, UK). Nach 4-stündiger Inkubation wurde die Absorption bei 570 nm und der Referenzwellenlänge bei 600 nm, und die prozentuale Verringerung der Biofilm Lebensfähigkeit lesen Sie die Formel des Herstellers berechnet.
Beurteilung entzündliche Veränderungen während der Biofilm Co-Kultur
Überstände und Zelllysate wurden aus OKF6 /TERT2 Zellen stimuliert mit unterschiedlichen Multispezies Biofilmen gesammelt, die jeweils für Protein- und Transkriptionsanalyse verwendet wurden, die Regulierung der pro-inflammatorische Mediatoren zu bewerten. Anfängliche Genexpressionsanalyse wurde durchgeführt, eine benutzerdefinierte Verwendung entworfen RT 2 Profiler PCR-Array (Qiagen, Crawley, UK). RT 2 Profiler-Arrays sind ein SYBR® Greener ™ basierte Echtzeit-PCR, die gleichzeitig für die Erfassung mehrerer Gene von Interesse zu ermöglichen. Kurz gesagt, wurde RNA aus Zelllysaten extrahiert (Qiagen, Crawley, UK) und 55 ng /& mgr; l cDNA, die die RT synthetisiert mittels 2 Erststrang-cDNA-Synthese-Kits (Qiagen, Crawley, UK) gemäß Herstelleranweisungen. Kurz gesagt, 24 ul eines Mastermix enthält SYBR® Greener ™, cDNA synthetisiert, um die RT mit 2 First Strand-Kit (Qiagen) und RNase-freies Wasser zu jeder Vertiefung der RT 2 Profiler Platte hinzugefügt, die bereits die Vorwärts- und Rückwärts-Primer enthielten für die Gene von Interesse (IL-1α, IL-1β, IL-6, TNF, CSF2, CSF3, IL-8, CXCL1, CXCL3, CXCL5, CCL1 und GAPDH), basierend auf einer experimentellen Gingivitis Modell [22]. Zwei Wiederholungen jeder Bedingung wurden in der RT 2 Profiler verwendet, die bei zwei verschiedenen Gelegenheiten durchgeführt wurde.
Weitere Überprüfung durchgeführt wurde unter Verwendung von IL-8 Genexpression analysiert SYBR® Green basierte qPCR (Invitrogen) unter Verwendung von GAPDH als Housekeeping-Gen. Primersequenzen und Referenzquellen sind in Tabelle 1 aufgeführt Alle Primer gegen jede Bakterienspezies getestet wurden Spezifität zu gewährleisten, was der Fall war (Daten nicht gezeigt). RNA wurde in cDNA synthetisiert dann zu einem Mastermix gegeben, die 12,5 ul SYBR® Greener ™, 10,5 ul UV-behandelt RNase-freies Wasser und 0,5 ul Vorwärts /Rückwärtsprimer. Drei unabhängige Replikate von jedem Parameter wurden in zweifacher Ausfertigung mit MxProP Quantitative PCR-Maschine und MxProP 3000 Software (Stratagene, Amsterdam, Niederlande) und Genexpression normalisiert auf die GAPDH Housekeeping-Gen analysiert nach dem 2 -ΔΔCT
Methode [23 ]. IL-8 Freisetzung in Zellkulturüberstand wurde durch ELISA (Invitrogen, Paisley, UK) bewertet, als den Anweisungen des Herstellers. Die Ergebnisse wurden berechnet, um eine 4-Parameter-Kurvenanpassung unter Verwendung colorimetrischen Veränderung bei 630 nm (BMG-Labtech, Ortenberg, Deutschland) quantifiziert. Statistical analysis
Graph Produktion, Datenverteilung und statistische Analysen wurden
GraphPad Prism durchgeführt unter Verwendung von (version 4; La Jolla, CA, USA). Nach der Beurteilung, ob Daten zu einer Normalverteilung angepaßt, indem vor und nach der Datentransformationen, Einweganalyse der Varianz (ANOVA) und t
Tests wurden verwendet, signifikante Unterschiede zwischen unabhängigen Gruppen von Daten zu untersuchen, die einer Gaußschen Verteilung angenähert. A Bonferroni-Korrektur wurde auf dem p-Wert angewendet für multiple Vergleiche der Daten zu berücksichtigen. Nicht-parametrischer Daten wurden unter Verwendung des Mann-Whitney U-Test Unterschiede zwischen zwei unabhängigen Stichproben zu beurteilen analysiert. Student t-Tests wurden verwendet, statistischen Unterschiede zwischen den Δ
Ct-Werte der beiden unabhängigen Gruppen in Genexpressionsstudien beurteilt zu messen, auch wenn die Daten als Prozentsatz oder mehrfache Änderung in den Figuren dargestellt werden. Die statistische Signifikanz wurde bei P & lt erreicht;
0,05.
Ergebnisse
Quantitative Analyse eines Multi-Spezies-parodontalen Biofilm-Modell und Videos qPCR Beschallte wurden Multi-Spezies-Biofilme quantifiziert (2A). Es wurde gezeigt, dass quantitativ, dass S. mitis
die dominierende Spezies innerhalb der reifen Biofilm war (1,36 × 10 7 CFE /ml; 83,24%), Frankreich, gefolgt von F. nucleatum
(2,28 × 10 6; 15,16%), P. gingivalis
(3,53 × 10 4; 1,01%) und A. actinomycetemcomitans
(1,13 × 10 5; 0,58%). Der Biofilm Zusammensetzung wurde dann SEM-Analyse untersucht werden. Der Biofilm wurde gezeigt, eine dichte Komplex verschiedener Morphotypen von F. nucleatum
(2B und C) dominiert. Abbildung 2 Analyse von Multi-Spezies-Biofilme in anaeroben und aeroben Bedingungen. Multispezies-Biofilm wurden für 6 Tage in 24-Well-Platten auf Thermanox ™ Deckgläsern gezüchtet, wie zuvor beschrieben. Nach der DNA-Reifung extrahiert wurde für Masterpure ™ Gram-positive DNA-Reinigung-Kit Quantifizierung der einzelnen Arten SYBR® Greener mit ™ -basierten qPCR (A). Biofilm Morphologie wurde durch SEM bei 2000x (B) und 5000x (C) analysiert. Proben wurden auf einem JEOL JSM-6400 Rasterelektronenmikroskop betrachtet und verarbeitet und Bilder zusammengesetzt Photoshop-Software. Biofilme können komplexe (B) zu sehen. Bei höheren Vergrößerungen können unterschiedliche Morphologien mit S. mitis
und F. nucleatum
bilden die Mehrheit des Biofilms (C) identifiziert werden. Reife Biofilme waren auch kultiviert in Zellkulturmedien in 5% CO 2 für 4 und 24 Stunden vor der DNA-Extraktion und Quantifizierung der einzelnen Arten unter Verwendung von mit SYBR® Greener ™ -basierten qPCR (D). Alle Proben wurden in dreifacher Ausführung bei drei verschiedenen Gelegenheiten getestet. Die Daten sind Mittelwerte ± SD.
Um die Multi-Spezies-Biofilme in Co-Kultur mit epithelialen Zellen zu testen, untersuchten wir die Auswirkungen der Bewegung des Biofilm aus anaeroben Bedingungen innerhalb AS bis 5% CO 2 in KSFM. Hierzu untersuchten wir den Biofilm Zusammensetzung wie oben beschrieben. Wurden keine signifikanten Unterschiede in der Zusammensetzung und Menge der 4 Arten innerhalb des CO 2 Biofilm bei 4 und 24 h (Figur 2D) beobachtet. Es gab auch keinen signifikanten Unterschied zwischen den 24 h Biofilmen unter anaeroben Bedingungen gebildet und die dann in CO platziert 2 für weitere 24 h. Diese Biofilme wurden dann in einem Co-Kultursystem verwendet, um die biologischen Eigenschaften von zwei unterschiedlichen bioaktiven Mittel zu untersuchen.
Untersuchung der Wirkungen von bioaktiven Mitteln in einem mehr Spezies Biofilm Epithelzelle Kokultur-Modell
Zuerst zu optimieren die Konzentrationen von RSV und CHX in diesem Modell getestet werden wir Zytotoxizität Tests auf beiden Epithelzellen und auf biofilms.Oral Epithelzellen zeichneten für 30 min mit drei Konzentration des antimikrobiellen Wirkstoff CHX behandelt wurden (0,01, 0,05, 0,2% v /v ) und entzündungshemmenden aktiven RSV (0,01, 0,05, 0,5% w /v) vor dem Waschen mit PBS und nach 4 und 24 h vor der Zelllebensfähigkeit wurde bewertet inkubiert gemessen, um einen AlamarBlue® Assay. Die Daten zeigten eine signifikante Abnahme (p & lt; 0,001) in die Lebensfähigkeit der Zellen im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen, wenn Medien Epithelzellen mit CHX bei jeder Konzentration für beide 4 und 24 h (Figur 3A) inkubiert werden. Wenn Epithelzellen wurden cokultiviert mit RSV eine signifikante Abnahme in der Lebensfähigkeit der Zellen im Vergleich mit den Medien Kontrolle wurden unter Verwendung von 0,05 und 0,5% w /v RSV-Konzentrationen sowohl bei 4 (p & lt; 0,001) beobachtet, und 24 h (p & lt; 0,01), mit einer etwa 50% igen Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen zu jedem Zeitpunkt (3B) .Next, aus diesen Daten die Konzentrationen für den Rest der Studie waren 0,2% v /v CHX und 0,01% w /v RSV vorangebracht. Multi-Spezies Biofilme wurden mit den ausgewählten Konzentrationen von Wirkstoffen für 30 min und Biofilm Lebensfähigkeit behandelt gemessen unter Verwendung eines AlamarBlue® Assay (3C). Behandlung des Multispezies-Biofilm mit RSV beeinflussen nicht signifikant Biofilm Lebensfähigkeit im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle Biofilm. Die Behandlung mit CHX zeigten eine signifikante Reduktion (p & lt; 0,001) von 75% in Bakterien Lebensfähigkeit im Vergleich zu den unbehandelten biofilm.To festzustellen, ob die Behandlung mit dieser Wirkstoffe die Artenzusammensetzung des Biofilms verändert, sie für 30 min behandelt wurden dann DNA extrahiert und die Quantifizierung von jeder durch qPCR (Abbildung 3D) durchgeführt Arten. Die Daten zeigen keine signifikante Veränderung in der Zusammensetzung nach einer 30 min Behandlung mit CHX oder RSV im Vergleich mit dem unbehandelten Biofilm. Zur weiteren Untersuchung dieses Effekts SEM-Analyse wurde durchgeführt, um die Auswirkungen von jeder aktiven auf die Architektur der Biofilme Nachbehandlung (3E-J) zu untersuchen. CHX erschien den Biofilm zu destabilisieren, da die Komplexität des Biofilms reduziert wurde, während RSV schien keine optische Wirkung auf die Architektur zu haben. Abbildung 3 Unmittelbare Wirkung von Wirkstoffen auf die orale Epithelzellen und Multi-Spezies-Biofilmen. Die orale epitheliale Zellinie OKF6-TERT2 wurde mit 1 × 105 Zellen /ml in 24-Well-Platten für Toxizitätsstudien beimpft. Zellen wurden mit Konzentrationen von CHX behandelt (0,01, 0,05, 0,2% v /v) (A) und RSV (0,01, 0,05, 0,5% w /v) (B) 30 Minuten vor dem Waschen mit PBS. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde bei 570 nm und 600 nm abgelesen unter Verwendung des Alamarblue® Assay mit Absorption bewertet. Im Anschluss an diese Konzentrationen für den Rest der Studie ausgewählt wurden CHX 0,2% (v /v) und RSV 0,01% (w /v). Zur Untersuchung der Rolle von Wirkstoffen in Biofilm Behandlung Biofilme wurden für 6 Tage in 24-Well-Platten auf Deckgläsern gezüchtet, wie zuvor beschrieben. Reife Biofilme wurden mit 0,2% v /v CHX und 0,01% w /v RSV für 30 Minuten vor dem Waschen mit PBS behandelt. Biofilm Lebensfähigkeit wurde mit gemessenen Alamarblue® bei 570 nm und 600 nm (C) gelesen. Bakterielle DNA wurde extrahiert und jede Spezies mit quantifiziert SYBR® Greener ™ -basierten qPCR (D). Biofilme wurden auch durch SEM sowohl 2000x (E, G, I) und 5000 × (F, H, J) analysiert. Proben wurden auf einem JEOL JSM-6400 Rasterelektronenmikroskop betrachtet und verarbeitet und Bilder zusammengesetzt Photoshop-Software. Unbehandelte Biofilmen (E, F) verglichen mit behandelten Biofilme mit 0,2% (v /v) CHX (G, H) und und 0,01% (w /v) RSV (I, J). Die Proben wurden in dreifacher Ausfertigung bei drei verschiedenen Gelegenheiten und Daten analysiert werden Mittelwert ± SD (** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001).
Als nächstes haben wir die Auswirkungen der unbehandelten Multispezies-Biofilm bewertet OKF6 stimuliert Zellen, die den Biofilm induzierte Entzündungsmediatoren zu gewährleisten. Unter Verwendung des RT 2 Profiler verglichen wir Biofilm-stimulierten Zellen auf Medien Kontrollzellen nach 4 h die entzündlichen Eigenschaften des Modells (Tabelle 2) zu bestimmen. Deutliche Zuwächse wurden für alle Gene auf die RT beobachtet 2 Profiler auf ihre Expression während der induzierten experimentellen Gingivitis in menschlichen Probanden ausgewählt basiert, die von 4,39-fache Veränderung (CCL1) auf 249,8 fache Veränderung (IL-8) mit einem mittleren fache Änderung von 60 im Vergleich zu den nicht-stimulierten Mediensteuerung. Diese Daten wurden durch die Untersuchung IL-8 nachgewiesen unter Verwendung von spezifischen Primern in einer Reverse-Transkriptase (RT) qPCR-Tests (4B). Eine signifikante erhöht wurde einer 15,57-fache Veränderung (p & lt; 0,001) beobachtet nach 4 h und 312,88 fache Veränderung (p & lt; 0,001) nach 24 h, wenn an die Mediensteuerung (Tabelle 2) verglichen. Schließlich werteten wir die Zeilüberstände für die Freisetzung von IL-8 in diesem System, in dem es gezeigt wurde, dass nach 4 h (535 ng) und 24 h (450 ng), dass IL-8 Freisetzung signifikant erhöht war (p & lt; 0,001 ) im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen Medien (4C). Auf der Grundlage dieser kollektiven Daten haben wir gezeigt, dass die 4-Spezies Biofilm reproduzierbare inflammatorische Eigenschaften innerhalb einer epithelialen Kokultur model.Table 2 Pro-entzündliche Reaktion auf unbehandeltem Biofilmen
Gene Durchschnittliche fache Steigerung Bei
hat
SD (±)
Bedeutung
IL-1
10.820
8,918
p & lt ; 0,05
IL-1B
12,662
1.161
p & lt; 0,05
IL-6
31,876
2,366
p & lt; 0,001
TNF
48,821
24,623
p & lt; 0,001
CSF-2
59.200
28,294
p & lt; 0,001
CSF-3
43,331
37,126
P & lt; 0,001
IL-8
249,805
189,93
p & lt; 0,001
CXCL1
121,892
56,676
p & lt; 0,001
CXCL3
63,843
26,213
p & lt; 0.001
CXCL5
14.435
14.474
n/s
CCL1
4.397
4.629
n/s
Abbildung 4 CHX und RSV immunomodulate epithelialen Zell-Antworten auf Multi-Spezies-Biofilm-Co-Kultur in vitro. Die orale epitheliale Zellinie OKF6-TERT2 wurde mit Biofilmen Multispezies bei 1 × 105 Zellen /ml in 24-Well-Platten für die Co-Kultur beimpft. Biofilm wurden mit 0,2% vorbehandelt (v /v) CHX oder Zellen wurden mit 0,01% igem (w /v) RSV für 30 Minuten vor dem Waschen mit PBS und dann co-kultiviert mit unbehandelten Biofilmen oder Zellen jeweils für 4 und 24 h. Unbehandelte Kontroll Co-Kultur wurden ebenfalls enthalten. RNA wurde bei 4 h aus den Zelllysaten gewonnen wurde cDNA synthetisiert und pro-inflammatorischen Genexpression auf einer RT2 Profiler Platte (A) quantifiziert. Doppelproben von drei unabhängigen Experimenten wurden verwendet, und die Daten sind Mittelwerte ± SD relativ zu der Mediensteuerung. Die Proben wurden auch für IL-8 relativ zu Housekeeping-Gen GAPDH bei 4 und 24 h getestet unter Verwendung von mit SYBR® Greener ™ basiert qPCR (B). Die Überstände wurden auch auf exogenes IL-8, gemessen durch ELISA (C) analysiert. Die Proben wurden in dreifacher Ausfertigung aus drei unabhängigen Experimenten untersucht, Daten sind Mittelwert ± SD (** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001).
Wir bestimmt dann, wie CHX Behandlung des Biofilms betroffen Entzündung. Die Co-Kulturmodell wurde für 30 min mit Biofilme, behandelt mit 0,2% CHX verwendet. Folgende Kokultur epithelialen Zell-Lysate und Überstände wurden entfernt und für eine erhöhte Gen-Protein Entzündungsmarker getestet werden. Eine unbehandelte Biofilm und Epithelzellen nicht co-kultiviert mit dem Multispezies-Biofilm wurden als Kontrollen verwendet. Nach 4 h Co-Stimulation mit den CHX behandelten Biofilme zeigten wir keinen signifikanten Unterschied in der Genexpression, welche die RT 2 Profiler, obwohl IL-8 und CXCL1 insbesondere (4A) verringert wurden. Eine weitere Analyse der IL-8 mittels qPCR zeigte wiederum keinen signifikanten Unterschied in der Expression bei 4 h, während bei 24 h eine signifikante Abnahme von 5,65 fold wurde in der CHX behandelten Biofilms stimulierten Zellen (p & gt; 0,001) beobachtet (4B). IL-8-Protein-Expression wurde auch bei 4 und 24 h durch ELISA gemessen. Eine signifikante Reduktion (p & lt; 0,001). IL-8-Protein bei 4 h beobachtet wurde (10-fach) und 24 h (13-fach), wenn zur unbehandelten Kontrolle (4C) verglichen Schließlich
, Wir untersuchten die Wirkung von RSV behandelte Epithelzellen in dem Co-Kulturmodell. Epithelialen Zellen wurden 30 min mit RSV behandelt, gewaschen und co-inkubiert mit unbehandeltem Biofilmen für 4 und 24 h. Die RT 2 Profiler zeigte keine signifikanten Unterschiede in der Genexpression nach 4 h im Vergleich zu unbehandelten Biofilmen (4A). Eine weitere Analyse der IL-8 bei 4 und 24 h zeigte auch keine signifikanten Unterschiede in der Expressionsniveaus (4B). Jedoch bei 4 h eine signifikante Abnahme der IL-8-Protein-Spiegel (25-fach; p & lt; 0,001) und 24 h (13 fache; p & lt; 0,01) wurden als mit dem unbehandelten Biofilm Kokultur-Modell (4C Vergleich beobachtet ).
Diskussion
Biofilm-Modelle in vitro experimentellen Verwendung von Wechselwirkungen zwischen Biofilmen zu untersuchen und Epithelzellen Host ist wichtig, die Mechanismen der Krankheitspathologie zu verstehen und wie Wirkstoffe, die Host-Reaktion beeinflussen können. Unter Verwendung dieser maßgeschneiderten Multispezies-Biofilm Modell wir, dass die epithelial Entzündungsreaktion auf Multispezies Biofilmen gezeigt haben, können in Gegenwart von antimikrobiellen und entzündungshemmenden Verbindungen verändert werden.
Die Daten zeigen Kokultur von Epithelzellen und unbehandeltem Mehr -Spezies Biofilmen erzeugen einen signifikanten Anstieg sowohl Gen- und Proteinexpression bei 4 und 24 h. IL-8-Protein-Spiegel wurden an beiden 4 und 24 h in Co-Kultur von Epithelzellen und unbehandeltem Multispezies-Biofilme gegenüber den Zellen nur die Kontrolle signifikant erhöht. Zusätzlich erhöht der Genexpression einer Vielzahl proinflammatorischer Chemokine und Zytokine einschließlich IL-6, IL-8, TNF, CSF-2, CXCL1 und CXCL3 bei 4 h im Vergleich mit den Zellen nur die Kontrolle beobachtet wurden. Diese dynamischen Veränderungen in der pro-inflammatorischen Mediatoren zeigen, dass es Wechselwirkungen zwischen dem komplexen Biofilm und den Epithelzellen ist.
