2 dann für RNA geerntet Die E. coli-Serotyp
0127: B8 LPS wurde durch Phenolextraktion gereinigt, wie zuvor beschrieben [43]
Genotyping
Genomische DNA wurde aus Hoks (DNeasy Tissue Kit, Qiagen, Valencia, CA), und der Konzentration, gemessen durch Nanodrop Extinktion extrahiert (. ThermoScientific, Wilmington, DE). Die UTR 'hBD1 5 wurde in der Abteilung für Genome Sciences, University of Washington, mit freundlicher Genehmigung von Dr. Robert Livingston oder durch polymorphe DNA Technologies Inc (Alameda, CA) unter Verwendung von Primern, die spezifisch für Exon 1 (Tabelle 1) .Tabelle 1 Oligonukleotid sequenziert PCR-Primer verwendet
Name
Sequenz
Anneal. Temp.
DNA-Sequenzierung
|
|
HBD1 SEQ
AACTCTAGCAGGTACCAGAGCTTACCT
< td>
65
|
CTAACCTAGAAAACCAAACAGGAGGAG
|
|
DEFB1 SNEST
TGAGGCCATCTCAGACAAAA
|
65
|
GCTCCAGGCGTAAAGCTAAA
|
|
QPCR
|
Primer Effizienz
|
HBD1
CACTTGGCCTTCCCTCTGTA
1,91
56
|
CGCCATGAGAACTTCCTACC
|
|
HBD2
GGAGCCCTTTCTGAATCCGCA
1,98
65
|
CCAGCCATCAGCCATGAGGGT
|
|
hBD3
GTGAAGCCTAGCAGCTATGAGGAT
1,68
60
|
TGATTCCTCCATGACCTGGAA
|
|
RPO
GCCTTGACCTTTTCAGCAAG
2,04
59
|
GCAGCATCTACAACCCTGAAG
|
|
Beta-Actin
CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT
1.75
63
|
AGCACTGTGTTGGCGTACAG
|
|
Vermeintliche RNA Faltung
die hBD1 mRNA Falzeigenschaften wurden unter Verwendung des MFOLD Programm (Rensselaer Polytechnic Institute geschätzt , Troy, NY) [44].
Plasmidkonstrukte kaufen Wir vier Konstrukte hergestellt, die die am häufigsten Haplotypen der drei bekannten hBD1 5'-UTR SNPs (-20, -44, -52) [31] (GenBank enthaltend Beitritt nicht. U50930; rs 11362, 1.800.972, 1.799.946) vor dem Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) Reporter Gens die pc DNA3CAT Plasmid verwendet (Invitrogen, Carlesbad, CA). Für Einzelheiten der Konstruktion Plasmid Weitere Datei 1. A mit dem CMV 5'-UTR und ein promotor pGEM-NCMV wurden konstruieren sehen erstellt und diente als Kontrolle. pKTCAT ist ein promotorloses CAT-Reporter-Plasmid, das die BamHI-Hind III-Fragment von CAT pSV0 CAT enthält, kloniert in die AatII-Hind III-Stellen von pUCl8 [45]. pcDNA3CAT ist eine positive Kontrolle CAT-Plasmid. Die Konstrukte mit den gemeinsamen Haplotypen waren: pGEM-ACG (-20 = A, -44 = C, -52 = G), pGEM-GCA und pGEM-GGG; ein zusätzliches Konstrukt pGEM-GCG, wurde auch als direkte Steuerung für den pGEM-GGG hergestellt, obwohl dieser Haplotyp nicht in der allgemeinen Bevölkerung [31].
Zellkultur und Transfektionen
COS-7-Zellen beobachtet gezüchtet und transfiziert wurden wie zuvor beschrieben [46] unter Verwendung von Lipofectamine plus-Reagens (Invitrogen) bei 20 & mgr; g /ml. Zellen wurden transient mit 1 ug jedes der fünf pGEM-Konstrukten transfiziert, pcDNA3CAT oder pKCAT (a promotor pcDNA3CAT) und co-transfiziert mit pSVβ-gal (Promega, Madison, WI) Normalisierung der Transfektionseffizienz zu ermöglichen. Nach 4 h wurde fötales Rinderserum auf eine Endkonzentration von 10% zugegeben. Die Zellen wurden nach 48 Std.
CAT und β-Galactosidase-Assays geerntet
Zwei Verfahren wurden verwendet, um CAT-Reporter-Protein-Expression, die ein radioaktives Enzym-Aktivitätstest, und ein Enzym-linked immunosorbant assay (ELISA) zur Quantifizierung von Proteinen zu messen. Proteinextrakte, hergestellt pro Protokoll des Herstellers in Reporter-Lysepuffer (Promega), wurden für die CAT-Aktivitätstest und der β-Galactosidase-ELISA-Test (Promega) verwendet. Für den radioaktiven CAT-Enzymassay, Zelllysate wurden mit Chloramphenicol (50 & mgr; M Endkonzentration) und 14C-Butyryl-Coenzym A (8,3 & mgr; Ci /mmol Endkonzentration) (Moravek Biochemicals, Brea, CA) hergestellt und zu 4 ml Econofluor II Szintillationsflüssigkeit (PerkinElmer, Wellesley, MA) (5 ml Gesamtvolumen), wie von Neumann et al beschrieben [47]. Die Radioaktivität an Chloramphenicol von CAT übertragen wurde 0,5 min /Rohr gezählt und Zählungen wurden während des Testzeitraums bis zählt plateaued in 45-Minuten-Intervallen wiederholt. Gewerbe CAT-Enzym (Promega) diente als positive Kontrolle. CAT-Aktivität, bestimmt durch die Aktivität von scheintransfizierten Proben subtrahiert (ohne Zugabe von DNA) wurde normalisiert Aktivität zu ß-Galactosidase. CAT und β-Galactosidase-Proteine wurden unter Verwendung von ELISA-Assays (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) entsprechend den Anweisungen des Herstellers quantifiziert. CAT-Protein wurde normalisiert auf & bgr; -Galactosidase-Protein. Beide Methoden zur Bewertung der Reporter-Protein-Expression wurden in Doppelbestimmung und wiederholt mindestens dreimal durchgeführt. Die T-Tests von Student wurde verwendet, um die CAT-Aktivität Ebenen zwischen dem pGEM-GGG -44 G-Konstrukt und den anderen 5'-UTR -44 C enthält Konstrukte zu analysieren. Der Wilcoxon Rank-Sum-Test wurde verwendet, um die CAT Proteinkonzentrationen aufgrund von nicht normalen Datenverteilung.
RNA-Extraktion und Echtzeit quantitative PCR (qPCR)
Gesamt-RNA wurde aus HOK Zellen unter Verwendung des RNeasy Mini Kit extrahiert zu analysieren (Qiagen, Valencia, CA). Reverse Transkription wurde mit 500 ng HOK RNA unter Verwendung des RETROscript Kits (Ambion, Austin, TX) mit Oligo (dT) Primern durchgeführt, um dem Protokoll des Herstellers entsprechend. Das Reaktionsgemisch enthielt 250 nM Oligo (dT) Primer, 10 mM Desoxynucleosidtriphosphat-Mix, 50 U reverser Transkriptase und 13 U RNase-Inhibitor und Puffer. QPCR Verstärkung der resultierenden cDNA wurde für hBD1, hBD2 durchgeführt, hBD3, Beta-Actin, und das Housekeeping-Gen ribophosphoprotein, RPO. Tabelle 1 listet Primer verwendet. QPCR wurde in einem MyiQ iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA) unter Verwendung der iQ SYBR ® Green Super-Mix (Bio-Rad) durchgeführt. Schmelzkurvenanalyse bestätigt, dass das Signal von der erwarteten Amplifikationsprodukt erzeugt wurde. Die Schwellenzyklen für Detektionsniveau hBD1, hBD2, hBD3 und beta-Actin wurden dem Housekeeping-Gen RPO normalisiert und verglichen unter Zelllinien mit drei Genotypen des -44 SNP (CC, CG, und GG). Die relative fache Änderung wurde von der Pfaffl Methode [48] berechnet. Da dieses Verfahren zum Vergleich eines Standard erfordert, haben wir eine Referenz von mRNA bestehend gepoolt aus 4 HOK Spender zufällig ausgewählt und als Basislinie für die gesamte Studie kombiniert. Die Ergebnisse werden für jede mRNA aus einzelnen Genotypen als relative fache Veränderung ausgedrückt im Vergleich zu dieser kombinierten RNA Referenzbasislinie. Messenger-RNA-Expressionsdaten wurden log-transformiert durch nicht normale Datenverteilung.
Antimikrobielle Assays
Epithelial Zellproteinextrakte für ELISA und mikrobiellen Assays wurden hergestellt aus Dreifach post-konfluente Zellkulturen in 24-Well-Platten gezüchtet. Die Kulturen wurden mit PBS gewaschen und mit eiskaltem Extraktionspuffer (50 mM Tris extrahiert, pH 7,4, 5 mM EGTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 enthält, Protease-Inhibitoren (1 Mini-Protease-Inhibitor-Tablette (Roche Applied Science) pro 7 ml Puffer) in Aliquots insgesamt 100 & mgr; l und gespeichert werden. Gesamt HOK Protein mit der BCA-Assay unter Verwendung von (Pierce Biotechnology, Inc. in Rockford, IL) gemessen. hBD-3-Peptid in HOK Extrakte
wurde durch ELISA untersucht ( PeproTechs, Rocky Hill, NJ) unter Verwendung von Kaninchen-Anti-hBD-3 nach Hersteller Verfahren. Proteinextrakte wurden 1/20 verdünnt und Standard hBD-3-Peptid (PeproTechs) wurde verdünnt, so dass die Pufferkonzentration äquivalent war in Probe und Standard-Peptidverdünnungen
Radial. Diffusionsassay zur Hemmung von Bakterienwachstum, wie aus dem Verfahren von Lehrer und Mitarbeiter [49]. kurz gesagt, Gram positive Staphylococcus epidermidis
UW3 [50] wurde bis zur mittleren log-Phase und zentrifugiert, beschrieben modifiziert wurde gezüchtet gewaschen und in 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,4 resuspendiert. Bakterien (4 x 10 6) wurden in 10 ml 1% LMP-Agarose (Invitrogen) mit 1% Todd Hewitt-Brühe, 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, zugegeben und in eine quadratische Petrischale. Drei mm Vertiefungen wurden gestanzt und 4 ul Kontrollpeptid oder HOK Proteinextrakt mit 4 & mgr; g Protein pro Vertiefung zugegeben. Platten für 3 Stunden bei 37 ° C inkubiert wurden Probe zu ermöglichen, in der Agarose absorbiert werden, dann zehn ml Nährstoff overlay Agarose (1% Agarose mit 200% Todd Hewitt-Brühe) zugegeben, und die Platten bei 37 ° C über Nacht inkubiert. Die Platten mit 10 ml 5% Essigsäure /25% Methanol-Lösung fixiert waren, wurden digitalisierte Bilder erhalten eine CCD-Kamera (Alpha Innotech, San Leandro, CA), und den Kreis der gemessenen Verrechnung über NIH ImageJ 1.38 u Software http: //RSB. Info. nih. gov /ij /. Die Messungen wurden in verblindet durchgeführt. Triplicate HOK Proteinextrakte wurden doppelt getestet. Die Ergebnisse wurden durch Vergleichen der Fläche der Zone der Clearing- minus der Fläche des gut für jede Probe analysiert.
Statistical analysis
Unterschiede in der mRNA-Expression und die antimikrobielle Aktivität durch Radialdiffusionsassay unter den drei -44 SNP-Genotyp Gruppen waren analysiert Einweg-Varianzanalyse (ANOVA). Weitere Tests auf einzelne Gruppen durch das Dunnett T3-Verfahren durchgeführt wurde [51], die nicht davon ausgehen, gleiche Varianzen. Für alle Vergleiche p ≤ 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
Ergebnisse | The -44 SNP die vorhergesagte Struktur des DEFB1 beeinflusst
5'-UTR Die DEFB1
5
'enthält UTR die -44 SNP-Stelle (rs1800972) sowie zwei zusätzliche SNPs (-20, rs11362 und -52, rs1799946). Um zu sehen, ob diese SNPs einen Effekt auf die mRNA-Sekundärstruktur haben die vorhergesagte Faltung und Gibbs-Energie wurden berechnet, indem MFOLD [44] für hBD1 mRNA mit gemeinsamen Sequenzvarianten oder Haplotypen (Abbildung 1). Die mutmaßliche Sekundärstruktur für die DEFB1
5 'UTR, die beiden häufigsten Haplotypen enthält, GCA (-52, -44, -20) (Abbildung 1) und ACG (nicht dargestellt), zeigen die -44 Stelle auf freiliegenden Schlaufen , aber diese Seite ist in dem natürlich vorkommenden GGG Haplotyp begraben, die die -44 G-Allel (Abbildung 1). Die Seite ist auch auf einer exponierten Schleife in dem GCG-Haplotyp (nicht gezeigt), die als direkte Steuerung für den Haplotyp GGG Sequenz entworfen wurde, wurde jedoch nicht in den Populationen analysiert in unserem Labor beobachtet. Diese putative strukturellen Eigenschaften führte uns 'für Wirkungen auf Reporter-Protein-Expression in einem Modellsystem 1 Putative Sekundärstruktur für die 5-UTR' UTR der mRNA DEFB1 die DEFB1
5 zu testen. Zwei der vier Haplotypen (-52, -44, -20 SNP-Stellen), die in der CAT-Konstrukte, wie berechnet und gezeichnet von der MFOLD Quikfold Programm. Die Standorte der SNP-Stellen sind eingerahmt und die -44 SNP-Stellen sind in roten Kästchen angezeigt. Beachten Sie, dass die -44 SNP-Stelle in der GGG Haplotyp in einem hybridisierten Stammstruktur ist. Im Gegensatz dazu ist gezeigt, wie durch die GCA Struktur dargestellt, ist die -44 SNP-Stelle in einer Schleife oder nicht-hybridisierten Konfiguration in den anderen drei Haplotypen. Ähnliche vermutlichen Strukturen wurden in drei getrennten Studien erhalten. Sekundärstrukturen mit der niedrigsten & Delta; G (G = Gibbs-Energie) wurden ausgewertet. Die & Delta; G-Werte sind: GCA = -13,5, GCG = -12,8, ACG = -10,5, GGG = -13,9, Die -44 SNP G-Allel führt zu einem erhöhten Reporter-Protein-Expression in vitro
Die genaue Wirkung der DEFB1.
-44 G-Allel auf die Genexpression wurde in COS-7-Zellen untersucht unter Verwendung von Konstrukten, die verschiedene Haplotypen des DEFB1
5 'UTR fusioniert mit dem CAT-Reportergen (2A). Zwei verschiedene Tests zeigten eine größere CAT-Expression für die pGEM-GGG konstruieren, um die -44 G-Allel. CAT Enzymaktivität betrug 1,7 fache (p & lt; 0,01) höher mit pGEM-GGG CAT als beobachtet mit pGEM-GCA und pGEM-GCG. Es war auch höher (1,5 fach, p = 0,01) als die pGEM-ACG-Konstrukt (2B). In ähnlicher Weise wie CAT-Protein-Expression durch einen ELISA gemessen, zeigte, dass pGEM-GGG die höchste Expression in COS-7-Zellen im Vergleich zu pGEM-GCA hatte (2,8-fach größer, p = 0,001), pGEM-GCG (1,6-fach größer, p = 0,036) und pGEM-ACG (1,5 fach höher, p = 0,047) (Figur 2C). Daher von beiden Assays CAT-Protein-Expression in Zellen, die das G-Allel -44 im Rahmen des natürlich beobachtet 5 'UTR Haplotyp, GGG, im Vergleich zu den beiden häufigsten Haplotypen mit dem -44 C-Allel, ACG signifikant erhöht und GCA. Reporter-Protein-Expression in Zellen, die mit dem GGG-Haplotyps, transfiziert war ebenfalls signifikant höher als das GCG-Konstrukt, das direkte 5 'UTR Kontrolle, was zeigt, daß die -44 G-Allels alleine Einflüsse Reportergenexpression. Figur 2: Wirkung der 5'-UTR-Haplotyp auf Reporterprotein-Expression. A. Schematische Darstellung der Reportergenkonstrukten; Einzelheiten der Konstruktion in Methoden und Zusatzdatei 1. Die Pfeile zeigen die SNP-Stellen in hBD1 5'-UTR zur Verfügung gestellt. Bent Pfeile zeigen Richtung der Übersetzung. Hellgraue Balken repräsentieren 5'-UTR. Konstruieren Sie Namen auf der linken Seite angegeben sind, umfassen die SNP-Haplotypen den letzten Teil des Namens. B. und C. CAT-Expression in COS-7-Zellen transient mit den Konstrukten transfiziert, enthaltend hBD1 (oder CMV) 5 'UTR. CAT-Expression normalisiert auf & bgr; -Galactosidase. (B) CAT-Aktivität durch radioaktive Enzymaktivitätstest gemessen. Mock transfiziert (ohne Zugabe von DNA) CAT-Werte wurden und CAT-Aktivität abgezogen wurde normalisiert Aktivität zu ß-Galactosidase erhalten durch ELISA Enzym-Aktivitätstest. (C) die Menge des CAT-Proteins wurde durch einen Antikörper-basierte ELISA und normalisiert auf & bgr; -Galactosidase-Protein gemessen. Schwarze Balken in B und C stellen Konstrukte hBD1 5'-UTR mit dem -44 G-Allel enthält. Die angegebenen Werte sind Mittelwerte und Standardfehler von 3 oder mehr Experimenten. Statistisch signifikante Unterschiede sind mit einem Stern im Vergleich zu pGEM-GGG angegeben. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0,001.
Genotypisierung von primären humanen Keratinozyten und Vereinigung der -44 SNP mit hBD1 mRNA-Expression
die Wirkung des DEFB1 Um zu untersuchen,
-44 SNP im Kontext des gesamten Gens, humanen Keratinozyten (HOK) 20-4 unabhängigen Spender wurden für die DEFB1
Exon 1-Sequenz ausgewertet. Sechzehn Zelllinien wurden für die gemeinsame Allel C an der -44-Website homozygot; sechs waren an dieser Stelle heterozygot; und zwei waren homozygot für das Allel -44 G (Figur 3). Die Allelfrequenz für das G-Allel -44 beobachtet (0,21) in der Nähe der zuvor berichtet [30, 31]. Die Frequenz des GG-Genotyp in der Bevölkerung vorausgesagt wird, 4%, bezogen auf Hardy Weinberg-Gleichgewicht, so hatten wir das Glück den GG-Genotyp in zwei Spender zu identifizieren. Alle Hoks mit einem oder mehreren Kopien mit dem -44 G-Allel hatten ein Genotyp im Einklang mit der GGG Haplotyp für die -52, -44, -20 SNPs in Übereinstimmung mit unseren früheren Bericht [31]. Abbildung 3 Genotypen bei DEFB1 5'UTR SNP-Stellen von 24 Keratinozyten-Gebern. Diejenigen Proben, die für weitere Studien verwendet wurden mit * gekennzeichnet sind.
Zwölf der HOK Spenderlinien, die die drei -44 Genotypen, 5 CC, 5 CG und 2 GG, wurden weiter auf mRNA und antimikrobielle Aktivität bewertet. Da wurden die kleinen Probengröße erhältlich und geringer Leistung zu zeigen Unterschiede zwischen den Gruppen, die statistischen Tests keine endgültigen Ergebnisse zu geben erwartet. Dennoch, da jede Spenderzelllinie in dreifacher Ausführung analysiert und einige Unterschiede waren groß, konnten wir statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen für mehrere Variablen zu demonstrieren. HBD1 mRNA-Expression war signifikant höher in jenen Zellen mit dem GG-Genotyp, verglichen mit dem homozygoten gemeinsame Allel C in Hoks in kultivierten sowohl 0,15 mM (p = 0,021) und 0,6 mM Calcium (p = 0,023) und mit dem heterozygoten CG-Genotyp (p = 0,024; p = 0,003 in 0,15 mM und 0,6 mM Calcium) (4A). Obwohl also unsere Probe des GG-Genotyp klein ist, Zellen mit diesem Genotyp haben signifikant höhere konstitutive hBD1 mRNA-Expression. Im Gegensatz dazu, beta-Aktin-mRNA-Spiegel waren nicht mit dem Genotyp korreliert (nicht dargestellt). Abbildung 4 Verband der konstitutiven antimikrobielle Genexpression mit dem DEFB1 -44 SNP-Genotyp. cDNA wurde aus primären Keratinozyten von 12 Spendern gewachsen in 0,15 mM Ca2 + (links) oder 0,6 mM Ca2 + (rechts) hergestellt. QPCR Amplifikation von cDNA für hBD1 (A) und hBD3 (B) und dem RPO Housekeeping-Gen wurde durchgeführt. Alle Daten wurden auf das Housekeeping-Gen normalisiert und im Vergleich zu einer separaten Referenz cDNA. Die vorgelegten Daten sind log2 transformiert sind und für 3 für jede Zelllinie mit doppelten QPCR Reaktionen repliziert. Der Mittelwert und std. dev. für jede Gruppe gezeigt. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01.
Auswirkungen der -44 SNP auf der konstituierenden Ebene von hBD2 und hBD3
Die Höhe der hBD2 und hBD3 mRNAs wurden mögliche Auswirkungen der DEFB1
-44 SNP auf andere β-Defensin-Gene zu identifizieren, bestimmt in das Chromosom 8p Defensin Cluster. Da die Kulturen auf Zytokine oder bakterielle Produkte, die nicht ausgesetzt wurden, stellen diese Werte die konstitutive Ebene der mRNAs. HBD2 mRNA-Expression war nicht signifikant mit dem DEFB1 korreliert
-44 SNP in entweder Wachstumsbedingung (p = 0,570, p = 0,577) (nicht gezeigt). Überraschenderweise fanden wir eine signifikante Korrelation mit dem DEFB1
-44 SNP und die Expression von mRNA in hBD3 beiden Wachstumsbedingungen (4B). Die Expression von hBD3 stieg mit der -44 G-Allel (CC & lt; CG & lt; GG). Hoks mit dem GG-Genotyp in 0,15 mM Calcium gezüchtet hatte eine mittlere Ebene der hBD3 mRNA 18-fach größer als die mit dem CC-Genotyp (p = 0,011). In 0,6 mM Calcium Hoks mit dem GG-Genotyp hatten 16-fach größere relative Expression der hBD3 als die mit dem CC-Genotyp (p = 0,002). In beiden Wachstumsbedingungen war hBD3 mRNA-Expression im GG homozygot Gruppe auch aus der heterozygot CG-Genotyp-Gruppe signifikant unterschiedlich. Diese Ergebnisse legen nahe, daß die -44 G-Allel in DEFB1
assoziiert ist mit einer erhöhten hBD3 mRNA-Expression.
Wir auch die Wirkung des DEFB1
-44 SNP auf hBD3 Peptid-Expression durch ELISA (effektive Reagenzien ausgewertet waren nicht für hBD1 und hBD2). Hoks mit dem GG-Genotyp hatten eine mittlere Ebene der hBD3 Peptid zweifach größer sind als die mit dem CC-Genotyp (ANOVA p = 0,014), aber dies war statistisch nicht signifikant in die weitere Analyse Bilanzierung von ungleichen Varianzen zwischen den Gruppen aufgrund der geringen Stichprobengröße (nicht gezeigt).
antimikrobielle Aktivität wird in Hoks stieg mit der -44 G-Allel
einem radialen Diffusionsassay wurde verwendet für die gesamte antimikrobielle Aktivität von HOK zu Testextrakte Staphylococcus epidermidis
UW3 Verwendung eines Gram positive commensal Haut Organismus, der zuvor gezeigt wurde hBD1 (unsere nicht veröffentlichte Ergebnisse) sowie hBD3 [52] anfällig. Der mittlere Bereich mit dem -44 G-Allel erhöht Clearing (CC & lt; CG & lt; GG) und Extrakte aus Zellen, die mit den GG-Genotyp zeigten eine signifikant höhere Zonen der Lichtung als die mit dem CC-Genotyp (p = 0,04) (Figur 5). Abbildung 5 Verband der DEFB1 -44 SNP-Genotyp mit erhöhter konstitutiv antimikrobielle Aktivität. Gesamt-Zelllysate aus kultivierten Keratinozyten hergestellt (4 ug Protein) wurden zu verfestigte Agarose gegeben, die S. epidermidis
. Die Fläche in Quadratmillimeter, zu löschen. minus der Fläche der Vertiefung wurde berechnet und die Ergebnisse verglichen mit Genotyp. Die Daten repräsentieren 3 Replikaten von jeder Zelllinie, und der Test wurde doppelt durchgeführt. Die Daten sind log transformiert und die mittlere und std. dev. Interferon-γ induzierte Niveaus von hBD1 und hBD3 mRNA gezeigt. Was sind korreliert mit Genotyp
Induzierte Ebenen der hBD1, hBD2 und hBD3 aus den zwölf Spendern in Hoks ausgewertet wurden (5 CC, 5 CG, 2 GG) in Gegenwart von LPS und PAM3CSK4, Liganden für TLR4 und TLR2 jeweils sowie IL1β, TNF & alpha; und IFN & ggr;. HBD1, hBD2 und hBD3 mRNA wurden durch LPS oder PAM3CSK4 nicht hochreguliert, wie erwartet. TNFa und IL1β induzierte hBD2 in sehr variablen Mengen in verschiedenen Zellspender, nicht mit dem Genotyp korreliert, hatte aber eine geringe Wirkung von hBD1 und hBD3 mRNA (nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu führte die Stimulation IFNy in signifikante Hochregulation von sowohl hBD1 (p = 0,02) und hBD3 mRNA (p = 0,005), die mit Genotyp mit dem gemeinsamen -44 CC-Genotyp mit durchschnittlich 12-fache und 100-fache Erhöhung gegenüber nicht-induzierten Niveaus korreliert, jeweils (Abbildung 6). Abbildung 6 Verband der DEFB1 -44 SNP-Genotyp mit hBD1 und hBD3 mRNA-Expression in Hoks mit IFNy induziert. QPCR wurde wie in Abbildung 4. Melden transformierter Mittelwert und Standarddurchgeführt. dev. werden gezeigt. Hinweis hBD1 und hBD3 mRNA im CC-Genotyp erhöht. Die Daten repräsentieren 2-3 Wiederholungen von jeder Zelllinie mit doppelten PCR-Assays.
Diskussion
Antimikrobielle Peptide eine wichtige Rolle als Teil der Schleimhaut und Haut angeborenen Immunität spielen. Daher genetische Variation, die in veränderten Peptidexpression resultiert, kann die Anfälligkeit für eine Infektion beeinflussen. Hier zeigen wir, dass die DEFB1
-44 G-Allels mit einem erhöhten konstitutive Expression sowohl hBD1 und hBD3 mRNA assoziiert ist, mit in oralen Keratinozyten antimikrobielle Aktivität erhöht und mit erhöhter Reporterprotein-Expression in transfizierten Zellen, was darauf hindeutet, dass der GG-Genotyp führt zu einer erhöhten Transkription der DEFB1
Gen oder mit einer verbesserten postTranskriptionsEreignisse. Wir zeigen auch die ersten Hinweise auf eine signifikante Beziehung zwischen der -44 SNP in der DEFB1
Gen mit der Expression von DEFB103
Gen hBD3 in der Nähe Gencluster kodiert. Die antimikrobielle Funktionstest unterstützt auch größere Peptid-Expression in Keratinozyten-Extrakten. Dieser Test ist für hBD1 nicht spezifisch, sondern könnte das Ergebnis einer erhöhten Expression anderer Defensine mit einem erhöhten Maß an hBD3 Peptid sein. Ergebnisse aus unserem Modellsystem sowie die Keratinozyten-Expressionsdaten zeigen, dass die SNP -44 G-Allel
DEFB1 ist mit einer erhöhten konstitutiv antimikrobielles Peptid Expression und Funktion verbunden. So werden im Rahmen der β-Defensin-Gene wird die -44 SNP mit einem direkten cis
Effekt auf die Expression von hBD1 und eine indirekte Wirkung auf hBD3 Expression assoziiert. Zusammen legen diese Ergebnisse nahe, einen Mechanismus, der genetische Studien unterstützt, die eine Korrelation zwischen dem DEFB1
5'-UTR -44 SNP G-Allel und Schutz vor verschiedenen Arten von Infektionen gezeigt haben [34-36, 39].
Der Ansatz Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.
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