Zusammenfassung
Hintergrund
Zahnbelag auf der Zahnoberfläche gebildet ist ein komplexes Ökosystem, bestehend aus diversen oralen Bakterien und Speichel-Komponenten. Anhäufung von Zahnbelag ist ein Risikofaktor für Zahnkaries und Parodontalerkrankungen. L-Arginin wurde durch Erhöhung Plaque pH durch die Aktivität von Arginindeiminase in oralen Bakterien das Risiko von Zahnkaries zu verringern berichtet. Hier untersuchten wir das Potential von L-Arginin aufgebaut oral Biofilmen zu entfernen.
Methods
Biofilme wurden mit menschlichem Speichel gemischt mit Gehirn-Herz-Infusionsbrühe mit 1% Saccharose in Platten mit mehreren Vertiefungen oder auf Kunststoffscheiben ergänzt gebildet. Nach dem Waschen der Biofilme mit Kochsalzlösung, Citrat (10 mM, pH 3,5) oder L-Arginin (0,5 M, pH 3,5) wurden die zurückgehaltenen Biofilmen durch Kristallviolett-Färbung, Rasterelektronenmikroskopie analysiert und Illumina Basis 16S rDNA Sequenzierung.
Ergebnisse
Waschen mit sauren L-Arginin abgelöst oral Biofilmen effizienter als Kochsalzlösung und wesentlich reduziert Biofilmmasse zurückgehalten in Platten mit mehreren Vertiefungen oder auf Kunststoffscheiben. Illumina-basierte Mikrobiota Analyse zeigte, dass Citrat (pH 3,5) vorzugsweise Streptococcus
von reifen oralen Biofilm ausgewaschen, während saure L-Arginin mit 10 mM Citratpuffer (pH 3,5) hergestellt unspezifisch mikrobiellen Komponenten der oralen entfernt Biofilm.
Schlussfolgerungen
Saure L-Arginin mit Citrat-Puffer (pH 3,5) hergestellt effektiv destabilisiert und entfernt reifen orale Biofilme. Die saure L-Arginin hier beschriebene Lösung könnte als Zusatz verwendet werden, die die Wirksamkeit von Mund verbessert in der Mundhygiene verwendet Spülungen.
Stichwort
L-Arginin Biofilm Mundspüllösung Oral microbiome Saliva elektronische ergänzendes Material
Der online Version dieses Artikels (doi:. 10 1186 /s12903-016-0194-z). enthält Zusatzmaterial, das autorisierten Benutzern zur Verfügung
Hintergrund
Es gibt vermehrt Hinweise darauf, dass eine Verschlechterung der Mundhygiene verbunden ist mit periodontal disease [1] als auch ein erhöhtes Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen [2, 3], metabolisches Syndrom [4, 5] und Frühgeburt [6]. Mundhygiene Pflege wird auch als ein kritisches Maß erkannt, dass die Risiken für die Gesundheitsversorgung-assoziierten Pneumonie (HCAP) reduziert. Oral Biofilme können als Reservoir für Pneumonie-verwandten Bakterien wirken, wie durch die Ähnlichkeit zwischen oralen Mikrobiota und klinischen HCAP Proben [7-9] vorgeschlagen. Viele klinische Studien, die die Wirksamkeit der Mundhygiene Pflege auf Prophylaxe für HCAP untersucht, einschließlich Lungenentzündung von der mechanischen Beatmung entstehen, berichtet. Diese Studien gefunden: (i) mechanische und chemische Mundhygienemaßnahmen reduziert die Rate der Erreger von Atemwegserkrankungen Kolonisation in oralen Mikrobiota [10, 11]; (Ii) die Mundhygiene Pflege entweder mit Chlorhexidin Mundwasser oder Gel wurde bei kritisch kranken Erwachsenen mit einer 40% igen Reduktion der beatmungsassoziierten Pneumonie [12]; und (iii) mechanische Mund Reinigung signifikant das Risiko für tödliche Lungenentzündung reduziert [13].
Mundhöhlen enthalten diverse Mikrobiota, die Zahlen fast 700 Arten [14]. Dieses Ökosystem umfasst Biofilm-bildenden Bakterien, wie Streptococcus mutans
, Fusobacterium nucleatum
, Porphyromonas gingivalis
und Aggregatibacter actinomycetemcomitans
. Obwohl die Mikrobiota zwischen den Individuen variiert innerhalb eines bestimmten Individuums ist die orale microbiome relativ stabil [15]. Allerdings kann die orale mikrobielle Zusammensetzung schnell unter eingeschränkten Bedingungen ändern, die während der Hospitalisierungen [16] auftreten können. Daher ist für kritisch kranke Patienten Mundhygiene Pflege ist besonders wichtig, Kolonisierung multiresistente Bakterien oder übermäßiges Wachstum von respiratorischen Erregern zu verhindern. Unzureichende Mundhygiene kann bei der Bildung von reifen Zahnbelag auf der Zahnoberfläche oder oralen Epithelzellen führen, und diese Plaque kann durch Spülen mit Wasser oder auch mit Handzähneputzen zu Reinigung resistent sein, was die Notwendigkeit für eine wirksame Strategien hervorhebt, die orale Biofilm unterdrücken Bildung. Verschiedene Studien, die die Fähigkeit von Kräuterextrakten zu testen [17], Desinfektionsmittel [18, 19], Inhibitoren der Polysaccharid-Produktion [20, 21], und seltene Zucker [22] zu reduzieren Bildung von oralen Biofilmen durchgeführt wurden.
Kürzlich , alkalierzeugende Mittel, wie L-Arginin und Harnstoff vorhergesagt wurden, das Wachstum von acidogene oder aciduric Bakterien zu hemmen, indem der pH-Wert der oralen Umgebung erhöht [23]. Metabolisierung von L-Arginin und Harnstoff durch Urease Arginindeiminase und jeweils erzeugt Ammoniak. Viele Mundbakterien besitzen eine Arginin-Deiminase-System, das L-Arginin metabolisiert Ornithin und Ammoniak zu erzeugen, die den pH-Wert der oralen Biofilmen erhöht. Klinische Studien L-Arginin-enthaltende Zahnputzmittel oder Mundspülungen Untersuchung zeigte eine protektive Wirkung gegen die Entwicklung von Zahnkaries in jungen Probanden [24, 25]. Darüber hinaus L-Arginin und Fluorid synergistisch S. mutans
Wachstum und die Biofilmbildung unterdrückt wird [26].
L-Arginin ist eine basische Aminosäure, die eine Guanidingruppe enthält. Wie Guanidinhydrochlorid, kann L-Arginin Protein Löslichkeit erhöhen und Proteinaggregation unterdrücken [27]. Obwohl der genaue Mechanismus für die L-Arginin-vermittelte Hemmung der Protein-Protein-Wechselwirkungen unklar bleibt, L-Arginin kann mit Proteinen oder das Wasser die Oberflächenspannungen von Proteinen verändern, ohne die dichte Befestigung durch Wechselwirkung mit anderen Mitteln gesehen, wie Guanidinhydrochlorid sie umgebende [28]. Da diese mild Wechselwirkung Proteinfunktionen bewahrt, L-Arginin wurde zur Solubilisierung von exogen exprimierten Proteine oder Antikörper, die zur pharmazeutischen Verwendung eingesetzt. Darüber hinaus wurde L-Arginin kürzlich berichtet die Infektiosität von umhüllten Viren wie Herpes-simplex-Virus und Influenza-Virus zu verringern, wahrscheinlich aufgrund kompromittiert Funktion von Proteinen in der Hülle [29].
Oral Biofilm ist ein komplexes Ökosystem, das ist bestehend aus verschiedenen Bakterien, Glucan und Speichel Glykoproteine. Das Entfernen dieser festen biologischen Plaque von Zahnoberflächen durch einfaches Spülen mit Wasser oder auch mit mechanischen Bürsten kann schwierig sein. Rest Plaque dient auch als Basis für die weitere Bildung von Biofilmen. Da L-Arginin zu erwarten ist oral Biofilmbildung zu hemmen und auch komplexe Aggregate in Zahnplaque, die Aufnahme dieser Aminosäure in einer Mundspülung destabilisieren könnten orale Biofilm Entfernung erleichtern. In dieser Studie haben wir das Potential von L-Arginin als Reinigungsmittel ausgewertet zu entfernen bereits etablierten oralen Biofilmen.
Methods
Töten Test für Streptococcus mutans
Glycerinstammkulturen von S. mutans
GS5 wurden auf Hirn-Herz-Infusion (BHI) -Agar Platten ausgestrichen, die dann anaerob für 48 h bei 37 ° C inkubiert wurden. Anaerober Kultur wurde unter Verwendung eines AnaeroPack System (Mitsubishi Gas Co., Ltd.) durchgeführt. Mehrere S. mutans
GS5 Kolonien wurden in BHI-Bouillon inokuliert und für 48 h bei 37 ° C kultiviert. Die Kulturen wurden bei 15.000 rpm für 5 min und resuspendiert in Kochsalzlösung zentrifugiert. Bakteriensuspensionen (0,1 ml) wurden in 0,9 ml Kochsalzlösung zugegeben, 10 mM Citrat (pH 3,5) oder 0,5 M L-Arginin in 10 mM Citrat (pH 3,5). Nach Inkubation für 5 min bei 37 ° C, serielle 10fache Verdünnungen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) wurden hergestellt und 0,1 ml der geeigneten Verdünnung wurde auf BHI-Agarplatten ausgebreitet. Nach einer 72 h anaerobe Inkubation bei 37 ° C wurde die Anzahl der Kolonien gezählt und mit der Anzahl in der Salzbehandlung verglichen. Biofilm Hemmtest
Zum inhibitorische Wirkung auf S. mutans Biofilm
GS5 beurteilen Bildung, 0,1 ml Kochsalzlösung, 10 mM Citrat (pH 3,5) oder 0,5 M L-Arginin pH3.5-7.0 (eingestellt mit 10 mM Citrat-Puffer) wurden mit einem gleichen Volumen der Bakteriensuspension gemischt (1% v /v von 48 h Kultur) in 2 x BHI, das 2% Saccharose. Die Gemische wurden auf 96-well Platten gegeben und anaerob bei 37 ° C inkubiert. Nach einer 24-stündiger Kultivierung, die auf die Wellböden gebildet Biofilme wurden durch Kristallviolettfärbung quantifiziert, wie unten beschrieben.
Sammlung von menschlichen Speichelproben
Nach schriftliche Einverständniserklärung von neun gesunden Probanden (21-27 Jahre erhalten alt , männlich), wurden sie gebeten ausgeschieden Speichel zu sammeln, während Wachs Kaugummi für 5 min zu kauen. Ausschlusskriterien waren jünger als 20 Jahre alt sind oder Antibiotika-Behandlung innerhalb der letzten 4 Wochen empfangen zu haben.
Reinigende Wirkung von L-Arginin auf die orale Biofilm auf Kunststoffscheiben gebildet
menschliche Mund Biofilme auf 13,5 mm sterile Plastikscheiben gebildet wurden (Sensi-Disc, Sumitomo Bakelite Co., Ltd., Tokio), stellen in 24-Well-Kulturschalen. Die Scheiben wurden in 0,5 ml BHI, die 1% Saccharose und 20% menschlichem Speichel gesammelt von drei gesunden Probanden (# 1 bis # 3) inkubiert. Nach einer 72 h anaerobe Kultivierung wurden die Scheiben entfernt und einmal mit Kochsalzlösung gewaschen. Die Biofilme auf den Scheiben wurden weiter mit 0,5 ml 10 mM Citrat (pH 3,5) gewaschen, der 0,5 M jeweils von L-Arginin, L-Alanin, L-Glycin oder L-Lysin (all den pH-Wert bei 3,5 bis 10 mM eingestellt Citrat) von bei 37 ° C für 30 min schütteln. Die Scheiben wurden dann erneut gewaschen mit 0,5 ml PBS (pH 7,4), gefärbt mit 0,5 ml 0,01% Kristallviolett für 20 min bei Raumtemperatur. Die Scheiben wurden dann viermal mit 1,0 ml Kochsalzlösung und luftgetrocknet. Nach dem Fotografieren wurde der verbleibende Farbstoff mit 0,5 ml 33% Essigsäure eluiert, indem 30 Minuten bei Raumtemperatur schütteln. Die Absorption der Eluenten bei 550 nm wurde dann gemessen.
Reinigungs Assay auf menschliche Speichel Biofilm Mikrotitervertiefungen
menschlichen Speichel von vier gesunden Freiwilligen gesammelt unter Verwendung von (# 4 # 7) wurden in BHI 1% Saccharose bei 20 enthält, % (v /v). Modifizierte menschliche Mund Biofilme wurden auch durch Zugabe von 48 h S. mutans
GS5 Kulturen (1% Endvolumen) hergestellt kariogen Biofilm zu simulieren. Jedes Gemisch (0,1 ml) wurde dann zu 96-Well-Platten und anaerob bei 37 ° C inkubiert. Nach 72 h wurden die Kulturen entfernt und der Biofilm auf der Unterseite der Platten geformt wurde einmal mit 0,2 ml Kochsalzlösung gewaschen. Jede Vertiefung wurde dann 30 min bei 37 ° mit 0,1 ml Kochsalzlösung (Kontrolle), 10 mM Citrat (pH 3,5, Lösungsmittel für L-Arginin in dieser Studie) oder 0,5 M L-Arginin (pH 3,5) unter Schütteln gewaschen C. Die Testreagenzien wurden dekantiert und jede Vertiefung wurde mit 0,2 ml Kochsalzlösung dreimal gewaschen. Der verbleibende Biofilm wurde 20 min bei Raumtemperatur mit 0,1 ml 0,01% Kristallviolett gefärbt. Nach der Färbung wurden die Vertiefungen viermal mit 0,2 ml Kochsalzlösung gewaschen, und der verbleibende Farbstoff wurde 30 min bei Raumtemperatur mit 0,2 ml 33% Essigsäure eluiert durch Schütteln. Die Extinktion der Eluate bei 550 nm wurde dann gemessen. Sechs Vertiefungen wurden für jede Probe in einem einzigen Assay verwendet. Assays wurden unabhängig voneinander dreimal wiederholt.
Rasterelektronenmikroskopie
menschliche Mund Biofilmen auf 13,5 mm sterile Kunststoffscheiben gebildet wurden unter Verwendung der Proben # 4 bis # 7. Die Scheiben wurden in 0,5 ml BHI, die 1% Saccharose und 20% menschlichem Speichel inkubiert. Nach einer 72 h anaerobe Kultivierung wurden die Scheiben entfernt und einmal mit Kochsalzlösung gewaschen. Die Biofilme auf den Scheiben wurden weiter mit 0,5 ml Kochsalzlösung, 10 mM Citrat (pH 3,5) gewaschen, oder 0,5 M L-Arginin (pH 3,5), indem bei 37 ° C für 30 min Schütteln. Die Scheiben wurden dann erneut gewaschen mit 0,5 ml PBS (pH 7,4), und die Biofilme auf den Scheiben wurden in 0,1 M Cacodylatpuffer (pH 7,2) mit 2% Glutaraldehyd fixiert. Nach der Fixierung wurden die Biofilme in einer abgestuften Ethanolreihe getrocknet und in einem Hitachi PCP-2 kritischen Punkt Trocknungsvorrichtung dehydratisiert. Die Scheiben wurden mit Platin /Palladium in einem Hitachi E-102 Sputter Coater beschichtet und mit einem JEOL JCM-6000 Rasterelektronenmikroskop untersucht. Der Bereich Biofilm bleibt nach wurde mit jedem Testreagenz Waschen gemessen, um die Farbe Auto-Auswahl-Werkzeug in Photoshop CS6 verwenden. Die Pixelwertverhältnisse des Biofilms Bereich Gesamtbeobachtungsbereich wurden bei 100-facher Vergrößerung von fünf zufällig ausgewählten Feldern berechnet. Mikrobielle Zusammensetzung Analyse von 16S rDNA-Sequenzierung
Speichel microbiome der sechs gesunden Freiwilligen
(# 4 # 9 ) wurde aus 3 ml Speichel extrahiert von Illumina Miseq 16S rDNA-Sequenzanalyse von DNA charakterisiert. Um die mikrobielle Gruppen identifizieren, die an Citrat oder L-Arginin Spülen empfindlich waren, menschlichem Speichel stamm gebildet Biofilmen auf 13,5 mm Kunststoffscheiben wurden mit den Testreagenzien oben beschrieben gewaschen. Die Testreagenzien wurden dann gewonnen, und die Bakterien aus den Waschlösungen wurden durch Zentrifugation (verwaschene Fraktion) gesammelt. Die Scheiben wurden dreimal mit 0,5 ml Kochsalzlösung gewaschen, in Stücke geschnitten mit einer sterilen Schere, und dann mit einem Bioruptor (Cosmobio, 3 x 1 min mit 1-min Intervall Ausgangseinstellung H) auf 0,5 ml Kochsalzlösung zur Beschallung überführt. Die abgelösten Biofilme wurden durch Zentrifugation (Dauer Fraktion) gesammelt. DNA aus beiden Fraktionen wurde ebenfalls gereinigt und die mikrobielle Zusammensetzung von 16S rDNA-Sequenzanalyse bestimmt.
DNA-Extraktion wurde nach der Methode durchgeführt, berichtet von Morita et al. [30]. Sequencing-Bibliotheken wurden durch Amplifizieren der V3-V4-Region des 16S-rDNA unter Verwendung der Primer von Klindworth et al beschrieben, hergestellt. [31]. Nach anfänglichen Amplifikation wurde eine zweite PCR Illumina Adapter sowie Barcodes zu befestigen, die zum Multiplexen erlaubt. Amplifikationen wurden in 25 & mgr; l Reaktionen, die 2,5 & mgr; l verdünnt Vorlage, 12,5 ul 2x KAPA HiFi HotStart Ready Mix und 2,5 ul jeder Primer durchgeführt. Wärmezyklus bestand aus einem anfänglichen Denaturierungsschritt (3 min bei 95 ° C), gefolgt von 25 Zyklen von Denaturierung (30 s bei 95 ° C), Annealing (30 s bei 55 ° C) und 30 s Extension bei 72 ° C. Die endgültige Verlängerungsschritt bestand aus 5 min bei 72 ° C. Amplikons wurden mit AMPure XP-Perlen (Beckman Coulter) gereinigt. Die Sequenzierung wurde auf der Illumina MiSeq Plattform (ver MiSeq Reagenzienkit. 3, 600 Zyklen) erfolgt nach den Angaben des Herstellers Paired-End in jeder Richtung liest von 300 Basen zu erzeugen. Insgesamt 10.381.210 2 x 300 Basenpaar liest mit durchschnittlich 432.550 liest pro Probe erhalten wurde. Primer-Sequenzen wurden beschnitten, und die Paired-End liest fusionierte mit fastq-join [32] mit Standardparametern und bearbeitet mit dem QIIME 1.8.0 Pipeline [33]. Nach einer Chimäre Prüfung durch Usearch 20.000 Illumina liest pro Probe (durchschnittliche Qualität der Gäste über 20) wurden zufällig für die weitere Analyse ausgewählt. Mit der UCLUST [34] Algorithmus in die QIIME Pipeline gebaut wurden Sequenzen bei & gt gruppierten; 97% Identität gegenüber dem Greengenes Referenzdatenbank, die Herstellung von 635 operativen taxonomischen Einheiten (OTUs). Mit Hilfe der QIIME Pipeline wurden ungewichtete UniFrac Entfernungen hergestellt und verwendet, um die Beta-Diversität untersuchen durch PCA Plotten Koordinaten
Nucleotid seqeunce
Sequenzdaten wurden in DDBJ Datenbank (Zugangsnummer: DRA004109, PRJDB4298, SAMD00042426-SAMD00042441) hinterlegt.. Statistik
die statistische Analyse der Daten wurde ver mit StatFlex ausgeführt. 6,0 (Artech Co., Ltd., Tokyo) unter Verwendung der Varianzanalyse (ANOVA), die Mittel aller Gruppen und gefolgt von Tukey-Test zum Vergleichen, die Mittel jeder der beiden Gruppen zu vergleichen. Die Daten wurden als signifikant verschieden zu sein, wenn die 2-tailed p
Wert wurde weniger als 0,05.
Ethik Zustimmung und Berechtigungen
menschlichen Speichel von neun gesunden Freiwilligen gesammelt wurden, nachdem eine schriftliche Einverständniserklärung erhalten. Ethische Genehmigung wurde von der Forschungsethikkommission der Medizinischen Fakultät der Universität Kagawa (Referenznummer, 27-074) erhalten.
Einwilligung Die Autoren veröffentlichen
erhalten Zustimmung von allen Teilnehmern die Analysedaten zu veröffentlichen, unter verknüpfbaren Anonymisierungs.
Ergebnisse
inhibitorische Wirkung von L-Arginin auf S. mutans
GS5 Biofilmbildung
Biofilm Assays, die die Wirkung von L-Arginin auf S. mutans
GS5 Biofilm zu bestimmen, durchgeführt wurden Bildung unter den Bedingungen pH-Wert von sauer bis neutral (pH3.5-7.0) reichen. Erstens S. mutans
GS5 Kultur wurde zu 2 x BHI 2% Saccharose bei 2% (v /v) enthält. Die Bakteriensuspension (0,1 ml) wurde dann mit Kochsalzlösung gemischt, 10 mM Citrat (pH 3,5) oder 0,5 M jedes der L-Arginin-Lösung eingestellt sein pH-Wert (3,5-7,0) und zu den Mikrotitervertiefungen aufgetragen. Nach 24-h anaeroben Kultivierung, Biofilm
S. mutans wurde durch Kristallviolettfärbung quantifiziert. Wie in gezeigt. 1, L-Arginin-Lösungen (Endkonzentration 0,25 M), die signifikant gehemmt S. mutans Biofilm
nach 24 h Kultivierung auf pH 3,5 eingestellt wurden, als mit Kochsalzlösung oder Pufferkontrolle (5 mM Citrat, pH 3,5) im Vergleich . Die Wirkung von L-Arginin war pH-abhängig, wobei nur L-Arginin-Lösungen signifikant gehemmt Biofilmbildung auf pH 3,5 eingestellt. Außerdem war diese Hemmung wahrscheinlich aufgrund einer bakteriziden Wirkung zu sein, da 10 mM Citratpuffer (pH 3,5) und L-Arginin auf pH 3,5 eingestellt reduziert S. mutans
GS5 Anzahl von nur 0,61 ± 0,30 und 0,49 ± 0,22 log
10 CFU /ml während einer 5-min Kontakt sind, und die optische Dichte der S. mutans
Kultur nach 24 h Inkubation unter den Proben nicht anders war ohne und mit 0,25 M L-Arginin-Lösung (pH 3,5). Diese Ergebnisse legen nahe, dass saure L-Arginin Biofilmstruktur destabilisiert und /oder reduziert Glucan Produktion von S. mutans
. Basierend auf diesen Ergebnissen, saure L-Arginin Lösungen pH 3,5 eingestellt wurden für nachfolgende Analysen verwendet. Feige. 1 pH-abhängige Hemmung von S. mutans
GS5 Biofilmbildung durch L-Arginin. Verwässertes S. mutans
GS5 Kulturen und Testreagenzien wurden mit 1: 1 gemischt. Nachdem die Mischungen für 24 h anaerob bei 37 ° C kultiviert wurden, S. mutans
Biofilmen, die am Boden der Mikrovertiefungen gebildet hatten, wurden durch Kristallviolettfärbung quantifiziert. Kochsalzlösung (S), 10 mM Citrat pH 3,5 (CA3.5) oder 0,5 M L-Arginin-Lösung mit 10 mM Citrat-Puffer auf einen pH zwischen 3,5 und 7,0 (angegeben als LA3.5-LA7.0) eingestellt wurden verwendet, wie Testreagenzien. Die Daten sind ausgedrückt als Mittelwert ± Standardabweichung. * Signifikant verschieden von Kochsalzlösung (p
& lt; 0,05) ** Signifikant verschieden von 10 mM Citrat (pH 3,5) (p
& lt; 0,05)
reinigende Wirkung von L-Aminosäure-Lösung auf oral Biofilm
Saliva abgeleiteten Biofilm auf Kunststoffscheiben mit den Speichelproben von gesunden Erwachsenen (# 1, # 2 und # 3) wurde hergestellt. Nach der Biofilm wurde mit 10 mM Citrat (pH 3,5), die jeweils L-Arginin, L-Glycin, L-Lysin oder L-Alanin-Lösungen 0,5 M gewaschen, die den pH-Wert auf 3,5 eingestellt wurden. Wie in gezeigt. 2a, die Kristallviolett Flecken auf den gewaschenen Platten mit L-Arginin waren weniger als die mit Citratpuffer gewaschen und die anderen drei L-Aminosäuren getestet. Die Kristallviolettfarbstoffe wurden mit Essigsäure eluiert und die Extinktion bei 550 nm der Elution wurde gemessen, um die Halte Biofilmen auf den Scheiben zu quantifizieren. Wie in gezeigt. 2b, L-Arginin effektiver menschlichen Speichel Biofilm reduziert als andere L-Aminosäuren, obwohl signifikanter Unterschied wurde nicht beobachtet. Feige. 2 reinigende Wirkung von L-Arginin auf die Speichel Biofilm auf Kunststoffscheiben gebildet werden. eine Kristallviolett-Färbung des Biofilms auf den Scheiben nach dem Waschen erhalten bleibt. , 0,5 M jedes der L-Arginin (Arg), L-Glycin (Gly), L-Lysin (Lys) oder; der Biofilm auf der Kunststoffscheibe gebildet wurde 30 min mit 10 mM Citratpuffer (pH 3,5 Cit) gewaschen L-Alanin (Ala), die den pH-Wert auf 3,5 mit 10 mM Citrat-Puffer eingestellt wurden. b Quantifizierung des Speichel Biofilm Halte auf den Scheiben. Das Kristallviolett wurde von den Scheiben gezeigt in Tafel A mit Essigsäure und deren Extinktion bei 550 nm eluiert wurde gemessen. Relative Werte Citrat Probe
destabilisierende Wirkung von sauren L-Arginin gezeigt auf die orale Biofilme
weiter zur Destabilisierung Wirkung von sauren L-Arginin (pH 3,5) auf die menschliche Mund Biofilm zu bewerten, wurden die Speichelproben gesammelt aus vier gesunden Probanden (# 4, # 5, # 6 und # 7). Illumina-basierte 16S rDNA-Sequenzanalyse zeigte, dass diese Proben die microbiome im Einklang mit mehreren früheren Berichten über die menschliche Speichel enthalten [35, 36]: Streptococcus
(vorherrschende, 23,2-44,5% Fülle Rate in dieser Studie), Prevotella
, Neisseria
, Veillonella
, Rothia
, Fusobacterium
, Gemella
, Porphyromonas
, Haemophilus
, Granulicatella, Poster und Actinomyces
häufig nachgewiesen wurden so reichlich Gattungen (siehe Zusätzliche Dateien 1, 2 und 3 für eine detaillierte Zusammenfassung der Fülle Raten).
Die Speichelproben wurden zu Mikrotiterstreifen enthält, BHI und 1% Saccharose (20% v /v) und Biofilme gebildet wurden folgende anaerobe Inkubation für 72 h. Interessanterweise unterschieden sich die Biofilm Eigenschaften unter den Proben, wobei die Speichel Biofilmen von zwei Individuen (# 5 und # 6) fest an den Vertiefungen angebracht (definiert als feste Biofilme), während die beiden anderen (# 4 und # 7) wurden leicht gelöst durch Waschen mit Kochsalzlösung (definiert als fragile Biofilme) (Fig. 3a). Waschen der Vertiefungen mit sauren L-Arginin abgelöst mehr Biofilmen von # 5 und # 6 als tat Salzlösung (p
& lt; 0,05), während 10 mM Citrat (pH 3,5) allein war ähnlich zu der Salzlösung. Feige. 3 Die Destabilisierung von oralen Biofilmen durch saure L-Arginin. Reinigende Wirkung von Kochsalzlösung, 10 mM Citrat (pH 3,5) oder L-Arginin in 10 mM Citrat (pH 3,5) auf etablierte Biofilmen menschlichen Speichel unter Verwendung allein (a) oder menschlichem Speichel vermischt mit S. mutans
GS5 (1 v% /v) (b) wurde untersucht. Die menschlichen Speichel stamm Biofilme wurden in Mikrotiterplatten-vorbereitet. Nachdem mit den Testreagenzien Waschen wurden die anhaltenden Biofilme mit Kristallviolett gefärbt. Die Zahlen geben die IDs von Freiwilligen. Saline, 10 mM Citrat (pH 3,5) und saure L-Arginin (pH 3,5) werden von blauen, roten und grünen Spalten angedeutet ist. Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt, und die statistische Analyse wurde durch ANOVA, gefolgt von Tukey-Test durchgeführt. Die p
-Werten von weniger als 0,05 als signifikant betrachtet
wurden die kariogen Biofilm, S. mutans
GS5 wurde auf 1% des endgültigen Well-Volumen zu simulieren hinzugefügt. Die Zugabe von S. mutans
GS5 änderte sich die Biofilmstruktur und erhöht die Bindung an die Mikrotiterstreifen, vor allem in Speichelproben, die gebildet fragile Biofilmen (Abb. 3 und zusätzliche Datei 4). Ähnlich dem Biofilm Reinigungs Assay ohne S. mutans
GS5, saure L-Arginin signifikant mehr abgelöst Biofilm aus dem Speichel abgeleitet von # 5 und # 6 (Fig. 3a). Im Gegensatz dazu enthält Biofilm Stamm GS5 wurde empfindlich Waschen mit 10 mM Citrat (pH 3,5) (Fig. 3b). Inzwischen saure L-Arginin (pH 3,5) und 10 mM Citrat (pH 3,5) auch eher Biofilmen durch zerbrechliche Biofilm-bildenden Speichelproben (# 4 und # 6) und S. mutans
GS5 gebildet zu reduzieren, aber wurden keine signifikanten Unterschiede.
Biofilm-Struktur nach dem Waschen mit sauren L-Arginin beobachtet
weiter zu den menschlichen Speichel (# 4 bis # 7) -abgeleiteten Biofilm nach Waschen mit Kochsalzlösung, Citrat (pH 3,5) zu vergleichen, oder saure L-Arginin (pH 3,5), Rasterelektronenmikroskopie (SEM) durchgeführt. Biofilm wurde auf einer Kunststoffscheibe hergestellt jede der Speichelproben verwendet und mit den drei Testlösungen (Kochsalzlösung, 10 mM Citrat pH 3,5, oder 0,5 M L-Arginin pH 3,5) gewaschen. Der Halte Biofilm Bereich nach dem Waschen wurde bei fünf zufällig ausgewählten SEM Felder von Photoshop CS6 quantifiziert. Wie in gezeigt. 4, Biofilmmasse wurde durch saure L-Arginin (pH 3,5) in höchstem Maße reduziert. Bei Proben mit Salzlösung gewaschen und 10 mM Citrat (pH 3,5), dick, vliesartige Objekte wurden nach dem Waschen zurückgehalten, während saure L-Arginin die meisten dieser Strukturen (Weitere Datei 5) entfernt. Feige. 4 Quantifizierung der nachhaltigen oralen Biofilm nach der Reinigung. Oral Biofilme wurden auf Kunststoffscheiben durch anaerobe Kultivierung in BHI-Brühe, die Saccharose (1%) und menschlichem Speichel (10%) gebildet. Nach 72 h Kultivierung bei 37 ° C wurden die Platten mit 1 ml PBS (pH 7,4) gewaschen. Die Scheiben wurden weiter mit 1 ml Kochsalzlösung gewaschen, 10 mM Citrat (pH 3,5) oder 0,5 M L-Arginin (pH 3,5) für 30 min vor in 0,2 M Cacodylat-Puffer für Rasterelektronenmikroskopie mit 2% Glutaraldehyd fixiert. Biofilm Bereiche wurden mit einem farbbasierte Auto-Auswahl-Werkzeug in Photoshop CS6 gemessen, und die Verhältnisse bezogen auf das Gesamtbeobachtungsfeld berechnet. Mindestens fünf zufällig ausgewählten Feldern untersucht. Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt, und die statistische Analyse wurde durch ANOVA, gefolgt von Tukey-Test durchgeführt. Die p
-Werten von weniger als 0,05 wurden als mit sauren L-Arginin
Illumina-basierte 16S rDNA-Sequenzanalyse zu spülen signifikanten
Oral Bakteriengruppen anfällig zu sein wurde, um die Bakteriengruppen zu identifizieren, durchgeführt, die empfindlich waren Spülen mit saurer L-Arginin. Wir testeten Speichel Biofilm von den Proben # 4 und # 5 fest und zerbrechlich Biofilmen zu repräsentieren. Speichel-Biofilme wurden auf Kunststoffscheibe hergestellt und mit Kochsalzlösung, 10 mM Citrat (pH 3,5) gewaschen oder 0,5 M L-Arginin (pH 3,5) für 30 min. Die abgelösten Biofilm in den Testlösungen wurden durch Zentrifugation (verwaschene Fraktion) gesammelt. Die Halte Biofilmen auf den Scheiben wurden durch Beschallung und durch Zentrifugation gesammelt (Halte Fraktion) abgelöst. Die DNAs wurden von beiden Fraktionen gereinigt. Wie in gezeigt. 5, Streptococcus
und Lactobacillus
86,8-98,3% der Biofilmpopulationen in beiden geteilt beibehalten und verwaschenen Fraktionen. Feste Biofilm (# 5) enthielt mehr Lactobacillus
als fragile Biofilm (# 4). Interessanterweise sind die Streptococcus
Anteil in der verwaschenen Fraktion mit Citrat-Puffer (10 mM, pH 3,5) war höher als bei solchen mit Kochsalzlösung oder 0,5 M L-Arginin (pH 3,5). Auf der anderen Seite, Lactobacillus
eher auf die Scheiben nach dem Waschen mit Citrat (pH 3,5) zu halten. Diese Ergebnisse zeigten, dass Citrat (pH 3,5), vorzugsweise ausgewaschen Streptococcus
von beiden Biofilm-Typen. Auf der anderen Seite, die mikrobielle Profil der Waschfraktionen mit sauren L-Arginin behandelt wurden, war ähnlich der für saline gesehen, was darauf hinweist, daß saure L-Arginin (pH 3,5) unspezifisch auf Kunststoffscheiben gebildet Bakterien von Biofilmen abgelöst. Feige. 5 Vergleichende Mikrobiota Analyse von nachhaltigen und verwaschenen Fraktionen mit sauren L-Arginin. Fragile (von # 4) und feste Biofilmen (# 5) wurden auf Kunststoffscheiben gebildet, die dann mit Kochsalzlösung gewaschen wurden (S), 10 mM Citrat-Puffer pH 3,5 (CA), oder saure L-Arginin (LA). Die mikrobielle Zusammensetzung der Fraktion auf den Scheiben verbleibt und der verwaschenen Fraktion wurden verglichen, indem Illumina Basis 16S rDNA-Sequenzanalyse
Discussion
Arginine Deiminase in oralen Bakterien metabolisiert L-Arginin, das seinerseits den pH der wirft oralen Umgebung, die die Bildung von Zahnkaries kann unterdrücken. Somit wurde L-Arginin wurde als potentielles Ergänzung zur Mundhygienepflege [37] untersucht. Darüber hinaus haben hohe Konzentrationen von L-Arginin (5,0-10,0%) berichtet Biofilmbildung von kariogenen S. mutans
[26] zu hemmen. In dieser Studie untersuchten wir die reinigende Wirkung von L-Arginin auf die orale Biofilme die Vorteile dieser basischen Aminosäure für die Mundhygiene Pflege zu demonstrieren. L-Arginin Hemmung von S. mutans
Biofilmbildung war in der Tat pH-abhängig (Fig. 1), weil unter den Bereich der getesteten pH-Werten (3,5 bis 7,0), signifikante Verringerungen in der Biofilmbildung wurden nur bei pH 3,5 beobachtet . Daher testeten wir relativ hohen Konzentrationen (0,5 M) von sauren L-Arginin (pH 3,5) in dieser Studie und zeigte die Wirksamkeit dieser Lösung in bereits etablierten oralen Biofilmen zu entfernen. Weil L-Arginin verbessert Proteinlöslichkeit durch Protein-Protein-Wechselwirkungen beeinflussen, und dieser Effekt ist evident bei sauren Bedingungen [38, 39], die reinigende Wirkung auf die orale Biofilme durch saure L-Arginin, die hier beobachtet wurde, wahrscheinlich von einer Destabilisierung von bakteriellen abgeleitet ist Aggregation. im Verlauf dieser Studie Kolderman et al
. die destabilisierende Wirkung von L-Arginin berichtet Biofilme auf durch den Speichel von sechs gesunden Freiwilligen gesammelt gebildet [40]. Diese Studie berichtet, dass neutralen pH-L-arginin (0,1-0,5 M) effektiv oral Biofilm destabilisiert. Hier haben wir gezeigt, daß saure pH L-Arginin nicht nur die menschliche Mund Biofilm destabilisiert sondern auch inhibierte Biofilmbildung durch S. mutans
, obwohl es schwierig ist, die Ergebnisse in beiden Studien aufgrund der Unterschiede in der Biofilmtestsystem verwendet, zu vergleichen: die Kolderman et al. Studie verwendet filtriert zellfreien Speichel als Nährstoff, während wir hier BHI enthaltend 1% Sucrose als Trägermedium für die Biofilmbildung verwendet. Saccharose ist ein kariogen Zucker, die das Volumen und die Stärke der oralen Biofilm verbessert. Die Wirkung von Saccharose auf in vitro oralen Biofilmbildung wurde in dieser Studie deutlich beobachtet, wobei Saccharose hinzugefügt anscheinend die Biofilmmasse und seine Zusammensetzung mit einem deutlichen Anstieg in der Anzahl der stabförmigen Bakterien (Weitere Datei 4) verändert wird. Bedenkt man, dass Streptococcus
und Lactobacillus
die vorherrschenden Komponenten der oralen Biofilmen in dieser Studie (Abb. 5), wobei diese stabförmigen Bakterien waren wahrscheinlich lactobaclli getestet wurden. Solche Fest Biofilme in reichen Medien gebildet wird, kann schwierig sein, die von neutralen L-Arginin zu entfernen, und sauren Bedingungen kann eine Destabilisierung der Aggregate von L-Arginin zu erleichtern. In der Tat, Ikeda et al. zeigten, dass L-Arginin auf Influenzavirus Typ A war am deutlichsten, wenn der pH-Wert unter pH 5,0 [41] war die antivirale Wirkung von 0,7 M.
Wir wählten Citratpuffer den pH der L-Argininlösung, da dies zu justieren Säure Chelat-Aktivität. Die hemmende Wirkung von Mitteln auf mikrobiellen Biofilms chelatisierenden ist bekannt, wie durch die häufige Verwendung von EDTA oder Citrat in Katheterschleusenlösungen belegt wird.
